黑曲霉木聚糖酶XynⅢ与嗜热海栖热袍菌葡聚糖酶Glu的融合研究

论文摘要

木聚糖酶能降解木聚糖成木糖或木寡糖,在饲料、造纸、食品以及能源工业中它们有着广泛的用途。本实验室筛选的黑曲霉A-25是一株木聚糖酶高产菌株,它所分泌的β-1,4-内切木聚糖酶XynⅢ的最适温度为47℃、最适pH为3.8,不适于在高温高碱的生物工程环境下使用。本实验室保存有海栖热袍菌的嗜热内切葡聚糖酶基因glu,此葡聚糖酶具有较高的温度稳定性,最适温度在90℃以上。将木聚糖酶XynⅢ与葡聚糖酶Glu相连,希望能够提高该木聚糖酶的热稳定性,并能够获得同时具有双功能的酶。本课题通过融合PCR技术将木聚糖酶基因xynⅢ与葡聚糖酶基因glu通过linker相连,并导入重组载体pET20b（+）,在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。本实验构建了两个重组蛋白Glu-Xyn和Xyn-Glu,最后对两种重组酶的酶学性质进行了研究。Glu-Xyn和Xyn-Glu都具有双酶活性。其中Xyn-Glu融合酶的木聚糖酶活性与野生型XynⅢ相比,最适温度提高3℃,达到50℃;温度稳定性也大有增加,在50℃保温30分钟后还有60%的残余酶活,而野生型仅剩40%;最适pH都在3.8;pH稳定范围也比野生型适用更广。Xyn-Glu的葡聚糖酶活性与野生型Glu相比,稳定性增强,随着保温时间的延长,其残余酶活反而升高;二者的最适pH在3.8;最适温度≥96℃。Glu-Xyn融合酶的木聚糖酶活性与野生型XynⅢ相比,温度稳定性降低,50℃保温20分钟后已基本没有活性;最适pH都在3.8;最适温度都是47℃;不过其pH稳定范围也比野生型适用更广。Glu-Xyn的葡聚糖酶活性与野生Glu相比,最适pH变化很大,由3.8提高到5.8;温度稳定性略有提高,95℃保温60分钟后,还有80%的残余酶活;最适温度≥96℃。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 木聚糖酶的应用和研究
• 1.1.1 木聚糖酶的应用
• 1.1.2 木聚糖酶的研究
• 1.2 纤维素酶的应用和研究
• 1.2.1 纤维素酶的应用
• 1.2.2 纤维素酶的研究
• 1.2.3 嗜热纤维素酶
• 1.3 定向进化中蛋白融合的研究
• 1.3.1 定向进化的常用方法
• 1.3.2 融合功能结构域的研究
• 1.4 立题背景
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和载体
• 3.1.2 试剂与药品
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 仪器设备
• 3.2 实验流程
• 3.2.1 glu-xyn 融合基因的构建表达及酶学性质分析
• 3.2.2 xyn-glu 融合基因的构建表达及酶学性质分析
• 3.3 方法
• 3.3.1 融合酶构建
• 3.3.2 表达产物的纯化
• 3.3.3 重组酶酶学性质分析
• 4 结果与分析
• 4.1 融合酶的构建
• 4.1.1 融合酶基因glu-xyn 和xyn-glu 的构建
• 4.1.2 重组载体的构建
• 4.1.3 基因的测序与序列比对
• 4.2 融合酶的原核表达
• 4.3 融合酶酶学性质分析
• 4.3.1 融合酶之木聚糖酶的酶学性质分析
• 4.3.2 融合酶之葡聚糖酶的酶学性质分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 Xyn 与Glu 连接顺序对融合酶的影响
• 5.2.2 表达量不足及原因分析
• 5.2.3 连接肽对融合酶的影响
• 展望
• 参考文献
• ABSTRACT
• 附录1
• 附录2