基于过程控制优化的重组大肠杆菌高密度发酵研究

论文摘要

本文对重组Escherichia coli BL 21高密度发酵生产类人胶原蛋白（Recombinant human-like collagen, RHLC）的控制工艺进行了优化,研究内容包括：增加罐压的供氧操作方式,动力学模型,诱导阶段的控温方式、pH值和培养基中的C/N,代谢流分析,质粒稳定性,并首次将饥饿应激诱导的交叉保护作用引入发酵过程,结果表明：1)增加罐压是一种行之有效的增加供氧,促进细胞生长和产物表达的操作方式。在12.8L发酵罐体系中进行的实验中,DCW达到了77.3g/L,RHLC浓度达到了14.1g/L。在加压过程中C02溶解度的增加并没有对E. coli BL 21菌株造成不利影响,说明了此菌株具有一定的CO2耐受性。在发酵的最后阶段,补料量逐渐超过细胞生长的需求,细胞的比生长速率变得很低,此时,外源产物的表达以及代谢副产物和底物葡萄糖的积累,造成严重的细胞代谢负担,细胞老化自溶,KLaC*迅速下降,发酵进入一个不可控阶段,此刻应该作为发酵过程的终点。其动力学模型可归纳为：（1）分批阶段,（2）补料阶段,（3）诱导阶段,2)在30L发酵罐系统中对外源基因诱导条件进行了研究,利用神经网络模型和遗传算法对诱导阶段的温度控制、pH值和C/N进行优化,得到了最优诱导条件：采用变温诱导控制方式,42℃诱导3h后降温到39.4℃继续培养,诱导阶段pH值控制在7.03,补料中C/N控制在4.8 （mol/mol）。其理论最大RHLC表达量是12.5 g/L,最优条件下实际最大RHLC表达量达到了12.1 g/L。3)对代谢途径中间代谢反应采用拟稳态假设,进行代谢流分析,结果表明：（1）补料分批阶段,溶氧反馈补料和增加罐压操作条件下细胞的代谢通量存在着一定差异,溶氧反馈方式下,进入PP途径的代谢通量比例较高,而增加罐压时,进入TCA循环的代谢通量比例较高。（2）三种不同的诱导控温方式中,42℃诱导一直到发酵结束,进入PP途径的代谢通量比例最低,TCA循环的代谢通量比例最大,诱导强度最强；42℃诱导3h后降温到37℃,进入pp途径的代谢通量比例最高,诱导强度最弱；42℃诱导3h后降温到39℃,诱导强度适中。（3）三种不同诱导pH条件下,细胞的代谢通量有一定差异。pH 6.8时进入PP途径的代谢通量比例最高,细胞比生长速率最大；pH 7.0和pH 7.2时进入TCA循环的通量比例较高,适合产物表达。（4）三种不同诱导C/N条件下,细胞的代谢通量具有一定差异。其中C/N=6时,进入TCA循环的代谢通量比例最低,产乙酸量较大,不适合产物表达；C/N=5时,进入PP途径的通量比例高于C/N=4,而且产物比生成速率为最高；适当提高培养基氮源比例对蛋白产物表达有益。4)通过比较葡萄糖饥饿和酵母粉饥饿对高密度条件下细胞生长的影响,确定葡萄糖饥饿作为预诱导操作,结果表明：饥饿时间不宜过长,否则会影响目标蛋白的表达,而且在诱导一段时间后,细胞会过早老化自溶,细胞密度降低。经实验确定,葡萄糖饥饿0.5 h对诱导过程的细胞生长和产物表达有促进作用。5)通过在30L发酵罐中考察不同高密度发酵控制条件下重组E. coli的质粒稳定性,结果表明,比生长速率越高,质粒稳定性越低；培养温度越高,质粒稳定性越低；溶氧反馈补料方式,质粒稳定性较高,增加罐压操作,质粒稳定性较低；温度诱导阶段,质粒稳定性不高,采用变温诱导,降温后在一定程度上提高了质粒稳定性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 胶原蛋白与类人胶原蛋白
• 1.1.1 胶原蛋白
• 1.1.2 类人胶原蛋白的特点和应用
• 1.2 重组E. COLI高密度发酵过程的影响因素
• 1.2.1 代谢副产物
• 1.2.2 供氧能力
• 1.2.3 预诱导阶段
• 1.2.4 诱导阶段
• 1.2.5 质粒稳定性
• 1.3 发酵过程中的应激反应和交叉保护作用
• 1.4 神经网络和遗传算法
• 1.4.1 神经网络
• 1.4.2 遗传算法
• 1.5 代谢流分析
• 1.6 本研究的目的、意义及内容
• 1.6.1 目的与意义
• 1.6.2 实验内容及拟解决的问题
• 第二章 增加罐压对重组E. COLI高密度发酵的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 分析方法
• 2.2.4 氧传递能力计算方法
• 2.3 结果与讨论
• LaC^*和细胞生长的影响'>2.3.1 罐压、温度及搅拌转数对K_LaC^*和细胞生长的影响
• 2.3.2 增加罐压操作对细胞生长的影响
• 2.3.3 增加罐压操作过程发酵终点的判断
• 2.3.4 增加罐压操作的动力学模型
• 2.3.5 细胞自溶对氧传递能力的影响
• 2.3.6 增加罐压操作的质粒稳定性
• 2.4 本章小结
• 第三章 基于BP网络模型和遗传算法的诱导条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料与仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 诱导温度对细胞生长和RHLC表达的影响
• 3.3.2 诱导pH对细胞生长和RHLC表达的影响
• 3.3.3 诱导培养基C/N对细胞生长和RHLC表达的影响
• 3.3.4 基于BP网络模型和遗传算法的最优诱导条件求解
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组E. COLI高密度发酵代谢流分析
• 4.1 引言
• 4.2 代谢流分析方法
• 4.2.1 E. coli代谢网络的确定
• 4.2.2 代谢通量分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 生长阶段的代谢流分析
• 4.3.2 诱导阶段的代谢流分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 交叉保护作用对重组E. COLI高密度发酵的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料与仪器
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.3 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 葡萄糖饥饿应激对重组E. coli BL 21耐热性的影响
• 5.3.2 不同饥饿应激类型对高密度发酵的影响
• 5.3.3 葡萄糖饥饿应激强度对高密度发酵的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章 高密度发酵过程的质粒稳定性
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 比生长速率对质粒稳定性的影响
• 6.3.2 培养温度对质粒稳定性的影响
• 6.3.3 供氧方式对质粒稳定性的影响
• 6.3.4 诱导阶段质粒的稳定性
• 6.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 作者简介