一、肺组织粗提物影响人原发性肝癌细胞侵袭转移机制的初步探讨（论文文献综述）
黄丹萍[1]（2021）在《复方叶下珠通过自噬降解Caveolin-1促进β-catenin泛素化失稳抑制乙肝相关性肝癌的机制研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）目前仍是严重威胁人类生命健康的重大问题,复发转移是影响其临床疗效的关键环节。复方叶下珠（Compound Phyllanthus urinaria L.,CP）由叶下珠、半枝莲、黄芪、莪术、山慈菇五味中药组成,是深圳市中医院肝病研究中心在长期临床与科研实践总结的经验方,申报国家专利（申请号:201610517509.2）。前期已开展相关临床观察,结果显示CP可延缓乙肝相关性肝癌（HBV-associated HCC）进展,甚至阻止癌细胞的转移,然而,其抗癌与转移作用和机制尚不清楚。本研究发现,CP可显着抑制乙肝相关性肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。网络药理学和生物信息学综合分析乙肝相关性肝癌临床标本,预测Caveolin-1（Cav-1）可能作为CP主要靶点之一,介导其抗转移作用。而Wnt/β-catenin通路是CP抗乙肝相关性HCC的核心机制之一。进一步实验表明,高表达Cav-1细胞株可通过稳定β-catenin促进乙肝相关性肝癌的转移,而CP可诱导Cav-1自噬降解,通过泛素激活Akt/Gsk3 β介导的β-catenin蛋白酶体降解,从而减弱Cav-1的转移促进作用。此外,我们还通过体内和体外实验进一步证实了 CP的抗增殖转移作用。在小鼠肝癌移植和斑马鱼异种移植模型中,我们发现CP均能抑制乙肝相关性肝癌的生长和转移。综上所述,我们的研究不仅强调了CP在抑制乙肝相关性肝癌转移的功能,并进一步探讨了 Cav-1在介导Akt/GSK3 β/β-catenin信号轴调控晚期乙肝相关性肝癌进展中的关键作用。目的:研究复方叶下珠通过自噬降解Caveolin-1促进β-catenin泛素化失稳抑制乙肝相关性肝癌转移的作用和机制。方法:第一部分:CP对乙肝相关性肝癌的增殖表型的作用研究。1、采用不同浓度的 CP 溶液（0、30、60、120、240、300、480、600 μg/ml）干预HepG2,SMMC-7721,Huh-7 3种肝癌细胞,并利用CCK-8、细胞计数、克隆形成实验研究CP对肝癌细胞增殖、克隆形成的作用。2、利用pENTER-URG11质粒转染HepG2构建稳定性乙肝相关性肝癌细胞HepG2-URG11。利用划痕实验,Western blot实验验证乙肝相关性肝癌细胞HepG2-HBx和HepG2-URG11的迁移能力及转移相关蛋白的表达。3、采用不同浓度的CP溶液,干预HepG2-HBx和HepG2-URG11 2种乙肝相关性肝癌细胞,利用CCK-8、克隆形成实验研究CP对乙肝相关性肝癌细胞增殖、克隆形成的影响。第二部分:CP对乙肝相关性肝癌细胞转移能力的作用研究。1、采用不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μg/ml）干顸HepG2-HBx和HepG2-URG112种乙肝相关性肝癌细胞,同时120 μg/ml的CP溶液分别干预2种乙肝相关性肝癌细胞0h,24h,48h,72h,运用划痕实验,Transwell实验和Western blot实验研究CP对乙肝相关性肝癌的迁移侵袭能力和转移相关蛋白标志物的作用。第三部分:CP降低乙肝相关性肝癌中β-catenin蛋白稳定性的研究1、将不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,利用120 μ g/ml的CP溶液分别干预乙肝相关性肝癌细胞0 h,24 h,48 h,72 h,采用核质分离实验和Western blot方法研究乙肝相关性肝癌细胞总β-catenin,核β-catenin与胞浆中β-catenin蛋白含量改变2、将不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,利用免疫荧光技术标记β-catenin蛋白,采用超高分辨率激光共聚焦显微镜观察CP对乙肝相关性肝癌细胞中β-catenin表达水平和细胞定位的影响。3、将 Proteasome 抑制剂（Mg132 10 μ M）、蛋白合成抑制剂（Cycloheximide,CHX 10 μM）单独或联合CP溶液（120 μ g/ml）干预乙肝相关性肝癌细胞HepG2-HBx,采用Western Blotting实验观察CP对HepG2-HBx细胞中β-catenin蛋白合成和蛋白酶途径降解的影响。4、采用不同浓度CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,同时120 μ g/ml的CP溶液分别干预2种乙肝相关性肝癌细胞0h,24h,48h,72h,通过Western Blotting实验观察CP对β-catenin上游调控通路中P-GSK-3β、GSK-3β、P-AKT和AKT蛋白水平的影响;进一步采用GSK-3β抑制剂LiC1（20 μ M）或AKT抑制剂LY294002（LY,25 μM）联合CP溶液（120 μg/ml）作用于乙肝相关性肝癌细胞,通过Western Blotting实验观察CP对乙肝相关性肝癌细胞中β-catenin蛋白表达水平影响。第四部分:CP网络药理学及乙肝相关性肝癌生物信息学研究1、利用在线数据库TCMSP、TCMID查询CP各组分活性成分,筛选符合口服利用度（oral bioavailability,OB）和类药性（drug likeness,DL）条件的候选化合物;使用Cytoscape软件（version 3.2.1）对各药材的成分-目标网络进行可视化。2、使用NCBI GEO数据库获得乙肝相关性肝癌临床病人基因芯片;利用GEO2R软件识别乙肝相关性肝癌差异基因;利用韦恩图获得CP作用于乙肝相关性肝癌靶点;利用String数据库和Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）。3、使用DAVID数据库对乙肝相关性肝癌靶点基因进行富集分析,富集项目包括生物过程（biological process,BP）富集,分子功能（molecular function,MF）富集,细胞组分（cellular component,CC）富集及KEGG通路。第五部分:CP调控乙肝相关性肝癌细胞Cav-1自噬性降解的作用研究1、将不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,利用免疫荧光技术标记Cav-1蛋白,采用超高分辨率激光共聚焦显微镜观察CP对乙肝相关性肝癌细胞中Cav-1表达水平和细胞定位的影响。2、将不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,同时用120 μ g/ml的CP溶液分别干预乙肝相关性肝癌细胞0h,24h,48h,72h,采用Western blot方法研究乙肝相关性肝癌细胞Cav-1蛋白含量改变。3、为进一步探索CP对Cav-1的干预路径,分别将蛋白降解抑制剂Mg132（10 μM）和自噬抑制剂 CQ（30 μM）与 CP（120 μ g/ml）联用,采用 Western Blotting实验检测乙肝相关性肝癌细胞Cav-1蛋白含量改变。4、采用120 μ g/ml的CP溶液干预HepG2-HBx细胞,利用免疫荧光双染技术标记溶酶体标记物-溶酶体相关膜蛋白1（Lamp1）抗体和Cav-1,超高分辨率激光共聚焦显微镜下观察CP对HepG2-HBx细胞中Cav-1自噬性降解的影响。第六部分:CP通过抑制Cav-1激活Akt/Gsk3 β介导的β-catenin蛋白酶体降解途径的研究1、利用LipoFiterTM脂质体转染试剂将pcDNA 3.1（C）-CAV1质粒转染HepG2-HBx和HepG2-URG11细胞中构建CAV-1稳定高表达的乙肝相关性肝癌细胞系;利用X-tremeGENE siRNA 转染试剂将 pcDNA 3.1（+）-β-catenin 质粒瞬时转染至 Cav-1高表达乙肝相关性肝癌细胞株中构建的β-catenin低表达的HepG2-HBx-Cav-1细胞系。2、采用120 μ g/ml的CP溶液干预乙肝相关性肝癌Cav-1高表达和对照空载细胞株,运用划痕实验观察CP对高表达Cav-1的乙肝相关性肝癌细胞转移能力的影响。3、采用120 μ g/ml的CP溶液干预乙肝相关性肝癌Cav-1高表达细胞系、空载细胞株和空白细胞株,采用Western Blotting实验检测CP对各细胞株中转移相关蛋白 Vimentin,E-cadherin 和 N-cadherin 蛋白水平的影响。4、采用120 μ g/ml的CP溶液干预乙肝相关性肝癌Cav-1高表达细胞系、空载细胞株和空白细胞株,采用Western Blotting实验检测CP对Akt/Gsk3 β/β-catenin信号轴相关蛋白表达量的影响。5、采用120 μ g/ml的CP溶液干预HepG2-HBx-Cav-1细胞系,通过免疫共沉淀和泛素化实验观察CP对乙肝相关性肝癌细胞和高表达Cav-1细胞系中β-catenin泛素化的影响。6、将CP溶液（120 μ g/ml）与GSK-3 β抑制剂LiCl（20 μ M）或AKT抑制剂LY294002（LY,25 μM）联合作用于 HepG2-HBx-Cav-1 细胞株,通过 Western Blotting实验观察CP对乙肝相关性肝癌细胞中β-catenin、Cav-1、P-GSK-3 β、GSK-3β、P-AKT和AKT蛋白表达水平影响。7、采用 CP 溶液（120 μ g/ml）干预已敲低β-catenin 的 HepG2-HBx-Cav-1 细胞系运用划痕实验观察CP对β-catenin干扰后的HepG2-HBx-Cav-1细胞系转移能力的影响。第七部分:体内实验研究CP对乙肝相关性肝癌增殖转移的作用。1、于BALB/C裸鼠右侧肝区皮下注射HepG2-HBx和HepG2-null细胞系,构建裸鼠肝癌及乙肝相关性癌皮下肿瘤模型,不同浓度CP溶液（0、300、625 mg/kg）给药,观察瘤体大小变化;采用HE染色法观察裸鼠肺部转移灶数量。2、将HepG2-HBx细胞通过显微注射技术植入斑马鱼腹中构建斑马鱼乙肝相关性肝癌异种移植模型,采用不同浓度CP溶液（0、60、120 μ g/ml）作用于斑马鱼,利用Dil染色观察CP对肿瘤增殖和转移的影响;通过HE染色法进一步观察肿瘤大小变化;利用免疫组化实验观察CP对斑马鱼体内肿瘤的Cav-1、β-catenin、Vimentin和E-cadherin蛋白表达的影响。结果:第一部分:CP抑制肝癌细胞及乙肝相关性肝癌细胞的增殖能力。1、CP显着抑制HepG2,SMMC-7721,Huh-7 3种肝癌细胞的增殖活力和克隆形成能力,具有时间和剂量依赖性。2、CP对普通肝癌细胞HL-7702无明显毒副作用。3、成功构建HepG2-URG11细胞株;HepG2-HBx和HepG2-URG11 2种乙肝相关性肝癌细胞株比普通肝癌细胞株具有更强的增殖和迁移能力。EMT相关蛋白标志物发生明显改变。第二部分:CP抑制乙肝相关性肝癌的迁移侵袭能力。1、CP可抑制乙肝相关性肝癌细胞的伤口愈合能力和小室穿透能力。2、CP干预可影响乙肝相关性肝癌细胞EMT相关蛋白的表达,表现为Vimentin,N-cadherin蛋白的降低和E-cadherin的上升。第三部分:CP降低乙肝相关性肝癌中β-catenin蛋白稳定性。1、CP降低乙肝相关性肝癌细胞HepG2-HBx和HepG2-URG11中总β-catenin,核β-catenin 和胞浆 β-catenin 的表达。2、CP抑制乙肝相关性肝癌细胞HepG2-HBx和HepG2-URG11中β-catenin的核易位。3、CP通过蛋白酶体降解途径促进HepG2-HBx中β-catenin的降解。4、CP通过Akt/GSK3 β信号通路促进β-catenin的降解。第四部分:构建CP“成分-靶点 乙肝相关性肝癌疾病”作用网络。1、从数据库中筛选出CP各组分共76个潜在活性物质。2、交集分析得到181个CP对乙肝相关性肝癌的作用靶点,其中CAV-1是CP的核心靶点之一。3、富集分析提示CP作用靶点与多种细胞生物学功能相关,Wnt通路可能参与CP对乙肝相关性肝癌的抑制作用。第五部分:CP促进乙肝相关性肝癌细胞Cav-1自噬性降解。1、CP降低乙肝相关性肝癌细胞中Cav-1蛋白的表达,呈时间和剂量依赖性。2、CP可促进乙肝相关性肝癌细胞的自噬水平,通过自噬性降解途径促进Cav-1降解。第六部分:CP通过抑制Cav-1激活Akt/Gsk3 β介导的β-catenin蛋白酶体降解途径。1、CP可逆转Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞迁移能力的促进作用。2、CP可逆转Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞转移相关蛋白的调节作用。3、CP可干扰Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞Akt/Gsk3 β/β-catenin信号轴的调控作用。4、CP可抵消Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞β-catenin分布的影响。5、Cav-1过表达可逆转CP诱导的β-catenin降解,导致β-catenin积累。6、CP促进乙肝相关性肝癌细胞中β-catenin的泛素化积累。7、β-catenin敲低可抵消Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞迁移能力的促进作用。第七部分:CP裸鼠和斑马鱼乳腺癌异种移植模型中乙肝相关性肝癌的生长和转移能力。1、CP显着抑制裸鼠体内肿瘤的生长和肺部转移灶的形成。2、CP有效抑制斑马鱼异种移植模型肿瘤的生长和扩散;显着降低了肿瘤中Cav-1、β-catenin、Vimentin 和 E-cadherin 的蛋白表达。结论:1、CP在体内和体外均能有效地抑制乙肝相关性肝癌的生长和转移;2、利用网络药理学方法,通过搜索现有的公共数据库和系统分析,鉴定出181个与CP和乙肝相关性肝癌密切相关的潜在基因。其中,CAV-1被认为是核心功能基因之一。通路富集分析提示,Wnt/β-catenin信号通路参与了乙肝相关性肝癌进展过程中CP的抗癌和抗转移机制;3、机制研究发现,CP通过自噬途径降解Cav-1,导致β-catenin泛素化失稳,进而发挥抗乙肝相关性肝癌转移的作用。
马青[2]（2020）在《全蝎与蜈蚣多肽粗提物抗乙肝病毒研究》文中认为全蝎和蜈蚣已被用作中药数千年。全蝎和蜈蚣作为有毒中药,它们的毒液是独特的资源,其中包括丰富的具有高度靶向功能的蛋白质以及多肽类成分。全蝎、蜈蚣毒液的一些多肽提取物具有广泛的抗病毒作用,尤其是全蝎的5～10 KDa多肽片段与蜈蚣的5 KDa以下多肽片段活性最让人关注。本文研究了全蝎的蝎梢的多肽粗提物（peptide extract from scorpion tail,PEST）与蜈蚣的蜈蚣顶的多肽粗提物（peptide extract from centipede head,PECH）在HepAD38细胞中的抗乙肝病毒（Hepatitis B Virus,HBV）作用。主要研究内容和结果如下:1.超滤法制备全蝎与蜈蚣的多肽粗提物取蝎梢、蜈蚣顶于4℃匀浆后,使用超滤管进行超滤,全蝎取10 KDa以下5 KDa以上部分超滤液命名为PEST,蜈蚣取5 KDa以下超滤液命名为PECH,使用真空冷冻干燥机进行浓缩,浓缩液测得多肽浓度分别为6 mg/mL和5.5 mg/mL,重金属含量检测结果表明这两种提取物重金属含量均无超标。2.MTT方法测定PEST与PECH对肝癌细胞HepAD38与HepG2毒性在96孔板接种HepAD38细胞,使密度约为6×104个/孔,培养2天后,撤去四环素,分别加入PEST（0.125、0.25、0.5和1 mg/mL）、PECH（0.125、0.25、0.5和1 mg/mL）,另设空白对照组只加细胞培养液,培养2天后,换上新的含药培养液与空白对照培养液,继续培养3天后再使用MTT法在酶标仪570 nm处测定吸光度。HepG2细胞接种密度约为1×104个/孔,孵育12 h后,分别加入PEST及PECH。在孵育相应时间后（24、48、72 h）使用MTT法测定吸光度。实验结果表明,PEST、PECH作用于HepAD38细胞和HepG2细胞时,细胞存活率均在70%以上,PEST和PECH对肝癌细胞HepAD38和HepG2均无明显毒性。3.PEST与PECH在HepAD38细胞中的抗乙肝病毒作用接种HepAD38细胞培养2天后,撤去四环素,设置PEST组,PECH组,0.25μmol/L拉米夫定（Lamivudine,LAM）组,0.01μmol/L恩替卡韦（Entecavir,ETV）组,含有6.86?mol/L四环素（Tetracycline,TEL）的四环素组以及只加空白细胞培养液的对照组,培养2天后,更换一次,继续培养3天。吸取上清,收获细胞。使用乙型肝炎病毒核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒检测细胞上清的HBV DNA含量,ELISA试剂盒检测细胞上清的HBV表面抗原（Hepatitis B surface antigen,HBsAg）和HBV早期抗原（Hepatitis B early antigen,HBeAg）含量,经过细胞内总RNA提取和采用荧光定量PCR检测HBV X/S/preC/P基因表达量,蛋白印迹法检测HBV core蛋白的合成。实验结果表明,1 mg/mL PEST组和PECH组抑制HBV DNA效果最佳,1 mg/mL PEST组明显抑制HBsAg（P<0.05）、HBeAg（P<0.01）的分泌,1 mg/mL PECH组明显抑制HBsAg、HBeAg的分泌（P均<0.01）,1 mg/mL PEST组和1 mg/mL PECH组分别下调HBV P基因mRNA相对表达量（P均<0.05）;PEST对core蛋白合成几乎无影响,PECH能够抑制HBV Core蛋白合成,并且抑制效果接近于阳性对照药物LAM和ETV。综上所述,得到以下结论:PEST和PECH在HepAD38细胞株中表现出抑制HBV活性的作用。作用机制可能是PEST和PECH抑制HBV P基因相对表达量,PECH还抑制HBV core蛋白合成。
李城[3]（2020）在《双黄连组分中药干预结肠癌增殖和转移的机制研究》文中进行了进一步梳理结肠癌（colon cancer,CC）是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤,全球发病率和死亡率居高不下。在我国,结肠癌的发病率也呈逐年增高的趋势。临床观察发现,结肠癌早期症状不明显,相当一部分患者发现时已属于晚期,现有的治疗方案,预后和结局均较差。因此,探究结肠癌发生发展的分子机制,寻找预防及早期干预措施,是结肠癌研究中亟待解决的问题。大量研究表明,赖氨酰氧化酶样蛋白-2（lysyloxidase-like2,LOXL2）参与肿瘤的发生及演进过程,并与临床预后密切相关。LOXL2最初被普遍认为是一种分泌蛋白,分布于细胞外,主要功能是催化细胞外基质（extracellular matrix,ECM）中胶原蛋白和弹性蛋白的共价交联,对生理上维持ECM结构的完整性和稳定性以及病理上促进纤维化进程具有重要意义;近几年研究发现,LOXL2也参与了细胞内的反应,可以调控肿瘤细胞发生上皮-间质转化、影响肿瘤血管生成、诱导肿瘤缺氧等,在肿瘤进程中扮演着极为关键的角色。但是目前LOXL2在结肠癌的研究还比较少,为了进一步确认LOXL2在临床结肠癌样本中的表达情况以及在结肠癌演进过程中所发挥的确切作用与具体机制,我们进行了如下研究。首先我们通过TCGA数据库分析发现LOXL2在结肠癌等多种恶性肿瘤中表达异常;使用结肠癌组织微阵列进行免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）结果显示,LOXL2在结肠癌患者的组织中呈阳性表达,且其表达水平与肿瘤大小呈正相关;通过LOGpc在线数据库进行生存分析提示,LOXL2高表达与结肠癌患者临床不良预后相关,其表达水平可用于对处于Ⅱ期～Ⅲ期的患者进行临床分级。接下来,我们对LOXL2与肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）的关系进行了初步探讨。结肠癌组织微阵列IHC检测和公共数据库分析显示,结肠癌组织中LOXL2与CAFs的表达分布呈正相关;应用肿瘤细胞或重组LOXL2蛋白（rLOXL2）刺激小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,通过Western Blotting和细胞免疫荧光激光共聚焦观察发现,普通成纤维细胞被激活为CAFs;同时Transwell结果提示,肿瘤细胞或rLOXL2激活的CAFs可以进一步促进结肠癌CT26细胞在体外的迁移和侵袭。在结肠癌防治方面,本课题组在前期研究中,运用网络药理学方法发现双黄连所含化合物的药理作用与抗肿瘤密切相关,最终筛选得到“黄芩苷、绿原酸和连翘酯苷A”三个化合物的抗肿瘤活性最强,并配伍组成双黄连组分中药。在本研究中,我们以此为研究基础,先是基于均匀设计试验法,应用CCK-8实验、伤口愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验对双黄连组分中药各组分进行剂量和比例的优化,得到抗肿瘤活性最强的配方;然后通过肿瘤小鼠模型,进一步证实双黄连组分中药的抗肿瘤活性。双黄连组分中药抗结肠癌作用机制方面,我们制备皮下荷瘤小鼠和肺损伤合并肿瘤血转移小鼠模型,通过对皮下肿瘤组织和肺转移灶的Western Blotting和IHC染色发现,双黄连组分中药可以抑制肿瘤微环境中CAFs的表达;我们收集双黄连组分中药孵育的CAFs的培养上清,将其制备条件培养基用于培养CT26细胞,通过Transwell迁移和侵袭实验观察发现,双黄连组分中药能够显着抑制CAFs诱导的CT26细胞迁移和侵袭;应用分子对接技术,我们发现双黄连组分中药与LOXL2具有较好的结合活性;在体内实验中,对荷瘤小鼠皮下移植瘤的IHC染色和Western Blotting分析也提示,双黄连组分中药能够显着抑制肿瘤组织中LOXL2的蛋白表达;在体外细胞水平,双黄连组分中药对与CAFs共培养的结肠癌细胞中LOXL2蛋白表达水平也具有显着的抑制作用。综上所述,本研究发现LOXL2在结肠癌中呈阳性表达,并与肿瘤生长增殖及不良预后相关;肿瘤细胞来源的LOXL2能够激活CAFs,活化的CAFs又可以反馈作用于结肠癌细胞,显着促进其迁移和侵袭能力。而双黄连组分中药不仅可以在体内、外直接抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,还可以通过干预肿瘤微环境中CAFs的活化间接地影响结肠癌细胞生物学行为,其作用机制可能与抑制LOXL2表达有关。本研究的结果为结肠癌的临床治疗提供了新靶点和新思路。
孙亚军[4]（2012）在《酪丝亮肽对肝癌肺转移的治疗作用》文中研究表明目的：观察三肽化合物酪丝亮肽（Tyroserleutide, YSL）对人肝癌细胞肺转移的抑制作用,初步探讨其抑制肝癌细胞肺转移的机制。方法：1.采用尾静脉接种人肝癌细胞的方法建立裸鼠肝癌细胞的肺转移模型来观察YSL对肝癌细胞肺转移的抑制作用。2.应用Transwell小室实验模型观察不同浓度的肺组织粗提物对肝癌细胞MHCC97H和SK-HEP-1的诱导能力,寻找最佳诱导浓度。3.应用Transwell小室实验模型观察YSL对肺组织粗提物诱导的体外培养的两种人肝癌细胞株侵袭能力的影响。4.应用明胶酶谱分析法,观察YSL对经肺组织粗提物培养的两种人肝癌细胞株细胞培养上清中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs） MMP-2和MMP-9蛋白活性的影响。5.应用免疫印迹技术观察YSL对经肺组织粗提物培养的两种人肝癌细胞株细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响。6.应用实时荧光定量PCR法观察YSL对经肺组织粗提物培养的两种人肝癌细胞株细胞中MMP-2和MMP-9mRNA水平的影响。结果：1.YSL可以显着抑制裸鼠体内肝癌细胞转移至肺内的肿瘤灶数。2.不同浓度肺组织粗提物诱导人肝癌细胞的移动侵袭实验中,在一定浓度范围内随着肺粗提物浓度的提高其穿过下室的细胞数增多,与培基对照组比较具有显着差异。3.YSL可以显着抑制经肺组织粗提物诱导的细胞的体外侵袭能力。4.YSL可以显着抑制肝癌细胞培养上清中MMP-2和MMP-9的蛋白活性。5.YSL可以显着抑制肝癌细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平。6.YSL可以显着抑制肝癌细胞中MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平。结论：YSL具有抑制肝癌细胞肺转移的作用。体外研究表明肺组织粗提物具有明显的诱导肝癌细胞的作用,YSL对经肺组织粗提物诱导的肝癌细胞侵袭能力有明显的抑制作用,具有抗肝癌细胞肺转移的效果。该作用可能是通过下降基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达水平、抑制其活性来实现的。
唐建华[5]（2010）在《三维肝癌类组织体模型建立及肺侵袭关联蛋白筛查》文中认为平面培养模型是研究肝癌的发生发展和转移复发机制的较好模型,三维培养模型在平面培养模型的基础上更接近在体状况。目前还缺乏在三维状态下研究肝癌侵袭、转移等分子机制的实验模型。本研究应用了旋转壁式生物反应器和PLGA支架材料,旋转壁式反应器具有微重力和低剪切力的特点,PLGA生物支架能更好地支撑细胞形成的类组织结构。本文首先将人高转移性肝癌细胞MHCC97H利用生物反应器进行有PLGA支架的三维培养,MHCC97H细胞和支架粘附形成团块,随着培养时间的延长,细胞团聚集体更加紧密,且表面光滑,行成高转移潜能肝癌类组织体；组化显示,细胞紧密排列,电镜超微结构显示类组织体细胞具有了组织细胞特有的一些结构,例如桥粒和紧密连接。临床上葡萄糖、LDH、ALB、γ-GT和AFP常用来评价肝组织功能。与平面培养细胞相比,类组织体形成过程中葡萄糖消耗下降,LDH分泌增加,显示在类组织体形成过程中葡萄糖分解增强而葡萄糖氧化受到了抑制；类组织体形成过程中,y-GT和AFP的分泌也明显高于平面培养细胞,这些结果显示类组织体获得了HCC特征性酶（蛋白）产生和分泌的能力,并且结果同HCC病人血清病理特征一致。与平面培养细胞相比,流式细胞技术显示类组织体中较低的S和G2-M期细胞,说明其中的细胞生长和增殖不活跃。对类组织体HCC特征基因（AFP, ALB）、粘附分子基因（ICAM1,CD29）以及转移相关基因（CD44,E-cadherin, MMP9, MMP2）的检测发现三维培养的不同时段尤其是第15天,这些基因的表达明显不同于平面培养细胞,ICAM1和CD29的上调表达说明类组织体呈现了明显的细胞相互作用和连接的组织特征；白蛋白和AFP的表达增加和上述培养上清中的结果-致,说明类组织体部分具有了肝脏和肝癌组织的特征。肝癌转移相关基因CD44,MMP9,ICAM1,CD29表达增加和E-钙粘素的表达降低同临床转移性HCC特征相似。这些结果显示该模型不仅是HCC模型也和肝癌高转移潜能相关。免疫组织化学方法对ICAM1、CD29和AFP在类组织体中的表达检测结果显示这些蛋白相对平面培养细胞具有强表达,这些蛋白表达的模式与上述基因表达的模式一致。类组织体原位种植裸鼠肝脏形成的肿瘤组织结构呈现典型的HCC病理组织特征,HCC转移相关蛋白CK7,CK8,CK19和MMP9在再生瘤中具有高表达,证明再生瘤具有高转移潜能且存在肝内播散；在所有待测裸鼠的肺组织连续切片病理分析中,均发现有癌细胞转移,说明发生了肝癌肺转移,证实类组织体具有肝内播散和远端转移的能力。以上结果表明本文成功地建立了体外人高转移潜能肝癌类组织体模型,该模型建立所使用的类组织体原位移植形成肿瘤的方法可能成为建立动物模型的新方法,该模型也可能在药物筛选等方面具有良好应用。本研究还使用定量蛋白质组学方法对平面培养细胞和类组织体的蛋白组学性质也进行了分析,表明三维状态下的肝癌细胞在众多方面明显不同于两维的人肝癌细胞系。细胞三维形态结构及其周边组织结构对于肿瘤细胞恶性生物学功能的维持十分重要。肿瘤转移的靶器官环境对肿瘤细胞的侵袭和转移病理机制也有重要影响。肺转移是肝癌远端转移的主要形式。为了构建肝癌肺侵袭实验模型,体外再现癌细胞从黏附、侵袭到肺内癌巢形成的病理全过程,解决三维状态下缺少理想肝癌侵袭转移实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题,也为了深入解析在三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制,在高转移潜能人肝癌细胞类组织体研究的基础之上,研究首先对不同转移潜能的人肝癌细胞Hep3B和MHCC97H形成的类组织体进行了比较定量蛋白组学研究,获得三维培养状态下与转移关联的基因,并检测了其中部分基因在肝癌肺侵袭过程中的表达。接下来将高转移潜能人肝癌细胞系与裸鼠肺组织块共同旋转培养,建立了肝癌肺侵袭实验模型,对该病理过程中不同时段的混合类组织体进行比较定量蛋白质组学筛查,以期获得肺侵袭过程关联蛋白分子,研究其在侵袭转移中的生物学功能,明确其参与肝癌肺侵袭转移的分子机制；在发现的侵袭转移关联蛋白中,对冠蛋白1B （coronin 1B）的研究发现,该蛋白受抑制的细胞的运动速度比对照细胞降低了,而经肺组织粗提物诱导之后,该细胞的运动速度又明显增加了。说明靶器官性质和侵袭转移关联蛋白共同决定细胞的运动潜能。本研究建立的高转移潜能肝癌类组织模型以及肝癌肺侵袭模型是在三维状态下易于直接检测和观察的体外实验模型,相对平面培养模型更能模拟肝癌组织特征,相对动物模型,具有省时、简化的优势,并且排除了动物个体差异对实验结果的影响。第一部分新的体外高转移潜能肝癌类组织体模型的建立在三维状态下研究肝癌转移机制的模型缺乏,为了建立一个体外高转移潜能肝癌类组织体,更好地在三维状态下研究肝癌转移的机制,也为构建肝癌肺侵袭模型奠定基础,本研究首先使用RWV生物反应器,将MHCC97H细胞和PLGA支架混合旋转培养形成类组织体,使用形态观察、组织化学染色以及电镜观察等方法研究该类组织体的宏观和微观的形态；培养的类组织体随着培养时间的增加逐渐由松散、体积大变得紧密和体积小,形态学的观察显示该类组织体与平面培养细胞具有明显不同,出现了组织特有结构；使用酶联免疫标记等方法研究该类组织体形成过程中的蛋白产生和分泌的情况、葡萄糖代谢的情况；白蛋白等一些组织特有的酶、癌症和转移相关的酶的表达与平面培养细胞不同,更接近实体肿瘤；对一些组织、癌症和转移相关性基因表达分析也显示出了同样的结果；使用流式细胞仪技术对细胞的生长和凋亡的研究显示类组织体细胞的凋亡和增殖不活跃；使用原位种植裸鼠肝脏类组织体实验验证该模型的成瘤性和转移性,结果发现类组织体能在肝脏形成肿瘤,并且发生了肝内播散和肺转移,虽然已经有很多类组织体模型的相关报道,但是对成瘤性和转移性检测的研究在国内外还未见报道。所有的结果都显示该模型比单层培养肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞更好地模拟了转移性人肝癌组织的主要性质,三维状态下的肝癌细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、成瘤转移等方面明显不同于两维的人肝癌细胞系,和已有的临床肝癌组织病理特征相似,说明成功建立了高转移潜能人肝癌类组织体模型。研究结果可能在肝癌研究、抗癌药物筛选以及肝癌动物模型的建立方面有良好应用,同时也表明HCC细胞三维形态结构及其周边组织结构对于肿瘤细胞恶性生物学功能的维持十分重要。第二部分肝癌肺侵袭模型建立及肺侵袭过程关联蛋白功能解析为了建立在三维状态下的肝癌肺侵袭模型,为探讨肝癌肺侵袭的分子机制提供良好模型,并对该模型培养不同时间蛋白（过程蛋白）进行蛋白组学分析,进而筛查和肺侵袭相关联的蛋白,并进一步对部分关联蛋白进行验证和功能研究。本研究首先由MHCC97H类组织体和Hep3B类组织体的iTRAQ定量蛋白质组学比较得到一些和转移相关的基因；检测了其中部分基因在建立的肝癌肺侵袭模型培养不同时间的表达。建立肝癌肺侵袭模型培养初期,MHCC97H细胞聚集粘附于肺组织块周围,并有轻微肝组织浸润侵袭。接着癌细胞肺组织的侵袭变得越来越明显,培养至第16天,发现癌细胞已进入肺组织并形成癌巢。因此建立了宜于直接检测、观察的肝癌肺侵袭实验模型,模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肺内癌巢形成全过程。对该肺侵袭模型培养产物的转移相关基因的分析发现,MHCC97H细胞的转移潜能随着培养时间的延长增加了；用iTRAQ定量蛋白质组学的方法对该模型过程蛋白进行了动态的分析,发现了一些和肺侵袭相关联的差异蛋白,对部分差异蛋白的定量PCR验证了这些蛋白在mRNA水平的表达。慢病毒载体介导的RNA干扰对过程差异蛋白CORO1B进行了抑制,CORO1B受到抑制的细胞运动潜能明显降低了,经过肺组织粗提物的诱导,运动潜能又有增加。本研究成功地构建了体外肝癌肺侵袭实验模型,解决了三维状态下缺少理想肝癌肺侵袭实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题,有助于深入解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制；获得了与肝癌肺侵袭“过程”关联的差异蛋白,并对持续上调的差异蛋白CORO1B的生物学功能进行初步探讨,发现CORO1B影响细胞运动,肺组织粗提物也影响细胞运动,说明靶器官微环境与关联蛋白的协同决定细胞运动潜能。结论1.体外成功建立三维转移性人肝癌类组织体模型,其在组织形态结构、特征基因表达、蛋白分泌情况、动物成瘤及转移能力等方面具有更接近体内转移性肝癌实体瘤生长病理特征。2.三维状态下的肝癌细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、成瘤转移等方面明显不同于两维的人肝癌细胞系。3.细胞三维形态结构及其周边组织结构对于肿瘤细胞恶性生物学功能的维持十分重要。4.成功地构建出宜于直接检测、观察的肝癌肺侵袭实验模型,模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肺内癌巢形成全过程,解决三维状态下缺少理想肝癌肺侵袭实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题,有助于深入解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制。5.获得与肝癌肺侵袭“过程”关联的差异蛋白,并对持续上调的差异蛋白CORO1B的生物学功能进行初步探讨,发现CORO1B表达降低的MHCC97H细胞的运动潜能降低,而在肺组织粗提物的诱导环境中,COROIB表达降低的MHCC97H细胞的运动潜能同样降低,但与未加肺组织粗提物的MHCC97H比,其运动能力明显改善,说明靶器官微环境与关联蛋白的协同决定细胞运动能力潜能。创新点1.建立了具有创新意义的体外三维转移性肝癌类组织模型,为深入解析和发现三维状态下肝癌细胞恶性生物学分子机制及转移新机制打开思路,同时也为解决体外研究肝癌组织细胞病理特征缺少理想实验模型及肝癌放疗、化疗缺少理想体外实验评估体系等问题提供可能。2.构建出宜于直接检测、观察的肝癌肺侵袭实验模型,模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肺内癌巢形成全过程,解决三维状态下缺少理想肝癌肺侵袭实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题,有助于深入解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制。潜在应用价值1.高转移潜能人肝癌细胞类组织在模拟体内转移性肝癌生物学特征方面明显优于两维平板培养的肿瘤细胞,提供易于重复研究又相对简化的肝癌生长的特定体外模拟培养环境,有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为的实验解析,可解决体外研究肝癌组织细胞病理特征缺少理想实验模型问题及肝癌临床药物治疗缺少理想体外实验评估体系问题,同时该发明的应用也简单易行。2.肝癌肺侵袭模型形成过程中,分别获取不同时间点的混合类组织标本,进行肝侵袭转移过程关联蛋白、过程关联基因的筛查及动态分子病理、动态蛋白质组、动态基因组分析等。3.在肝癌肺侵袭模型形成过程中,将与粘附、侵袭转移关联的待评价药物依据不同剂量,直接溶入或加入培养液中混匀,通过对不同时程混合类组织体生长及病理特征评估变化来对药物的疗效进行体外组织水平实验评估。4.作为一种新型肝癌肺侵袭实验模型,可用于三维状态下肝癌细胞侵袭、转移的恶性生物学行为分子解析,及肝癌组织水平的体外基础实验研究。
徐冰[6]（2007）在《常见人体肿瘤转移动物模型的建立及相关机理研究》文中提出转移性是恶性肿瘤主要的生物学特性之一，也是导致肿瘤患者死亡的主要原因，即使对患者实施肿瘤切除，术后转移的发生也是影响手术疗效的主要障碍。肿瘤转移的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂生物学过程。因此，研究肿瘤的转移，就必然要建立与临床表现相近的肿瘤转移动物模型。人体肿瘤移植于裸小鼠建立人癌异种移植动物模型为肿瘤的深入研究提供了可能。皮下移植和原位移植是目前常用的两种方法。原位移植由于获得与人体肿瘤生长相似的微环境，更利于肿瘤恶性行为的表达，因此，建立肿瘤转移动物模型大多采用原位移植的方法。肝癌、胃癌和肺癌是常见的肿瘤，利用这三种肿瘤进行研究具有一定的代表意义。本课题利用不同程度免疫缺陷小鼠观察了人肝癌原位移植肿瘤在宿主体内的生物学特性差异；模拟临床，建立了人肝癌和人肺癌术后转移动物模型；同时利用经体内筛选建立的人胃癌高转移动物模型以及建立的人胃癌细胞株MKN-45mc，对肿瘤转移的相关机制进行探讨。一、目的1．建立人肝癌NOD-SCID小鼠和裸小鼠原位移植模型，并通过两种模型生物学特性的比较，对不同类型免疫缺陷动物在人肝癌异种移植方面的应用价值进行初步探讨。2．建立人肝癌术后转移动物模型，观察并比较手术切除肿瘤后对人肝癌小鼠皮下移植模型和原位移植模型的影响。3．建立裸小鼠人肺癌术后转移模型，为研究肺癌的转移机制和术后抗转移治疗提供适宜的动物模型。4．比较体内筛选前后建立的人胃癌原位移植动物模型，以及人胃癌细胞株MKN-45mc和MKN-45生物学特性出现的差异，对转移的相关机制进行探讨。二、方法1．将组织结构完整的SMMC-LTNM瘤块植入NOD-SCID小鼠和裸小鼠肝脏内，建立人肝癌原位移植模型。观察成瘤率、肿瘤体积和重量、脏器的转移情况以及血清甲胎蛋白（AFP）、γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ（γ-GTⅡ）等指标。2．将组织结构完整的HC-031瘤块植入NOD-SCID小鼠皮下和肝脏内，分别建立人肝癌皮下移植和原位移植模型。模拟临床肿瘤手术切除方法，切除皮下移植瘤和原位移植瘤，建立肝癌术后转移模型。观察肿瘤生长和动物的生存状况。通过病理解剖和组织病理学技术研究肿瘤在动物体内转移情况。3．将人非小细胞肺癌NCI-H460组织块植入裸小鼠皮下，建立皮下移植瘤模型。4w后，25只裸小鼠作为手术组切除肿瘤组织，建立术后转移模型，15只裸小鼠作为对照组。每两周两组各处死5只动物动态观察其远处各脏器转移情况。动物明显消瘦时结束实验。采用免疫组化方法检测MMP-2、OPN、CD44v6、CD62等蛋白在转移灶及原发灶的表达情况。4．用人胃癌MKN-45sci和MKN-45肿瘤组织块建立人胃癌原位移植动物模型，观察并比较两种模型的肿瘤生长和转移、血清肿瘤标志物及MMP-2、OPN、CD44v6、CD62与Timp-2的表达情况。取MKN-45sci肝转移灶形成的皮下移植瘤，用组织块法进行原代培养，建立MKN-45mc细胞株，观察肿瘤细胞的形态学、生长速度、体外侵袭能力、细胞周期变化，并与MKN-45细胞株进行比较。三、结果1．NOD-SCID小鼠人肝癌原位移植模型于5w可扪及肿瘤的生长，成瘤率为100％，11w肿瘤体积为（4.48±0.93）cm3，瘤重为（7.02±1.15）g，肺部转移率为53.85％；裸小鼠人肝癌原位移植模型于6w～7w可扪及肿瘤的生长，成瘤率为100％，11w肿瘤体积为（1.02±0.70）cm3，瘤重为（2.87±0.44）g，体内未见转移发生。NOD-SCID小鼠的瘤体积、瘤重、肺转移率均高于裸小鼠（P=0.000，P=0.000，P=0.011）。二者均保持AFP高分泌和γ-GT同工酶阳性的特性。2．人肝癌HC-031皮下移植模型和原位移植模型由于肿瘤负荷过大分别于11w和6w而出现濒死状态，荷瘤平均生存时间为75d和44d。病理解剖，皮下移植瘤模型未发现转移（0／7），原位移植瘤模型的肿瘤和邻近脏器侵袭明显，部分出现肺部转移（2／7）。皮下切瘤动物和肝原位切瘤动物分别于17w和12w出现恶病质现象，平均生存时间为154d和112d。病理解剖发现肺部均有肉眼可见癌性转移结节（7／7，7／7）。未切瘤动物和切瘤动物血清中AFP和γ-GTⅡ表达均为阳性。3．人肺癌NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤10w时瘤体严重坏死，并且动物出现明显消瘦，解剖未发现转移。手术组裸小鼠于10w、12w各发现一例肺转移（1／5），14w时裸小鼠明显消瘦，肺转移率达100％（5／5），有肉眼明显可见的肺转移结节，其他脏器未见转移。免疫组化结果表明，MMP-2、OPN、CD44v6、CD62和Timp-2在肺转移灶内的表达明显高于原发灶，CD54和MMP-9在转移灶内的表达则低于原发灶。4．人胃癌原位移植模型MKN-45sci组动物的肝转移出现早且转移率高，4w左右肉眼即可看到肝转移结节（100％），同时伴有淋巴结转移（100％）、肺转移（71％）、脾转移（29％）和腹水；移植瘤体积和重量明显增加，分别达到（3089±1617）mm3和（2.66±1.32）g，动物出现恶病质。而4w时MKN-45组肝、肺、脾未见明显转移灶，仅2只动物有淋巴结转移；小鼠未见明显消瘦，移植瘤体积和重量为（275±90）mm3和（0.35±0.14）g。MKN-45sci组血清中NSE和CYFRA21-1的浓度均较高，且随着肿瘤生长时间的延长而增高。而MKN-45组CYFRA21-1始终呈现阴性，4w时NSE仅为76.9 ng／ml。免疫组化结果显示MMP-9、OPN抗体在MKN-45sci组原位移植瘤和转移灶呈强阳性反应，而在MKN-45组原位移植瘤反应较弱。CD44v6抗体在MKN-45sci组原位移植瘤和转移灶呈阳性反应。E-cadherin抗体在MKN-45sci组原位移植瘤呈阳性反应，肝转移灶呈阴性反应。建立的MKN-45mc细胞株的染色体为超三倍体细胞，具有人类恶性肿瘤细胞染色体的特点。细胞形态为典型的上皮样细胞，与MKN-45的形态学特点相似。流式细胞分析显示MKN-45mc与MKN-45细胞周期各时相比例分别为：G0-G1期62.51％／53.95％，S期9.46％／1452％，G2-M期28.04％／31.53％，两株细胞DNA合成期的细胞比例均较高。MKN-45mc与MKN-45细胞倍增时间分别为34.8h和42.1h，前者的生长速度高于后者。MKN-45mc与MKN-45的36h体外过膜数分别为（60.38±8.86）／高倍视野和（32.50±17.26）／高倍视野，前者多于后者。四、结论1．建立了与临床表现相似的人肝癌动物模型。与裸小鼠相比，NOD-SCID小鼠在建立人肝癌的异种移植模型方面有更大的应用价值。2．模拟临床肿瘤切除方法，建立人肝癌术后转移动物模型。实验结果表明，荷瘤动物肿瘤切除后，生存期延长，有利于肿瘤转移发生。3．裸小鼠人肺癌术后转移模型模拟了临床肿瘤根除术后发生远处转移的过程，结果提示肺癌转移的发生可能与部分粘附分子的异常表达相关，同时为研究肺癌转移机制和术后抗转移治疗提供理想的动物模型。4．人胃癌原位移植动物模型体内筛选前后肿瘤的生物学特性不同，经筛选后肿瘤的生长和转移能力较未筛选的增强，其机理与肿瘤细胞粘附和降解能力得到强化有关。筛选后建立的细胞株生长速度、过膜能力比原细胞株增强，表明肿瘤转移与肿瘤细胞增殖和运动变形能力有关。
薛同春[7]（2007）在《趋化因子受体表达与原发性肝癌肺转移关系的研究》文中指出原发性肝癌是世界上第六位致死性肿瘤，在中国居第二位。在中国，肝细胞癌的发生与乙肝病毒感染等密切相关。由于肝癌临床症状的非特异性，多数患者发现时已失去了最佳的手术机会。非外科治疗如经动脉化疗栓塞（TACE）、射频消融（RFA）、经皮酒精注射（PEI）等治疗作用仍然有限。许多患者最终死于术后复发和转移。生物治疗（包括基因治疗）为肝癌转移治疗提供了新的方向。然而，肝癌侵袭和转移是个多步骤多基因的过程，涉及肝癌细胞的生物学特性，肿瘤局部微环境如基质金属蛋白酶，整合素，基质细胞和血管等，以及局部和系统免疫。趋化因子和趋化因子受体是免疫细胞归巢和定向趋化的关键分子。目前为止，功能明确的有50多个趋化因子和18个趋化因子受体。还有一些趋化因子及受体在功能上不是很明确。2001年，Mullar首次报道趋化因子受体在乳腺癌细胞表达并与肿瘤细胞转移相关，尤其是CXCR4与肺转移，CCR7与淋巴结转移密切相关。现在，越来越多的研究表明趋化因子受体可以在肿瘤细胞上功能性表达，尤其是具有高转移性的肿瘤细胞。因此，有学者提出假说认为肿瘤细胞器官选择性转移的行为与免疫细胞定向趋化有相同或相似的机制。致力于发现与肝癌肺转移密切相关的特异的趋化因子受体可以为肝癌肺转移提供潜在的治疗途径。临床上肝癌远处转移主要发生于肺、骨、脑和肾上腺，尤其是肺部转移，约为35％。本课题前期的研究表明小鼠肺粗提物对高肺转移潜能的肝癌细胞有显着的趋化作用。为本题的深入研究提供了进一步理论和实验依据。本课题旨在通过系统对比和分析不同肺转移潜能人肝癌细胞系趋化因子及受体表达谱，筛选出与肝癌细胞肺转移密切相关的趋化因子及受体，并对筛选得到的趋化因子受体进行深入的功能验证和分析，为肝细胞癌肺转移基因治疗提供新的靶点以及理论和实验依据。第一部分肝癌肺转移趋化因子受体表达谱分析及筛选本部分工作的主要目的是分析对比不同肺转移潜能肝癌细胞系趋化因子及受体谱，筛选与HCC肺转移相关趋化因子及受体。首先利用Premier软件设计18对趋化因子受体引物，RT-PCR分析SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3、HCCLM6五个肺侵袭转移潜能逐渐增强的人肝癌细胞系趋化因子受体谱。趋化因子及受体寡核苷酸基因芯片对比Chang liver、SMMC-7721、MHCC97-L、HCCLM3肺转移潜能逐渐增强的人肝癌细胞系趋化因子及趋化因子受体表达谱。RT-PCR结果表明四组不同转移潜能细胞系趋化因子受体表达谱存在显着差异（p＜0.01），其中CCR10、CXCR4、CXCR6表达随转移潜能增加逐渐下降趋势。HCCLM6表达谱中CCR3、CCR4、CCR10、CCR12及XCR1比SMMC-7721表达明显降低甚至缺失（p＜0.01），而CXCR1（p=0.006）、CXCR5（p=0.003）表达高于低转移潜能组SMMC-7721。MHCC97-H和MHCC97-L比较，除CXCR2、CXCR6、XCR1外均有统计学显着差异，其中CCR1（p=0.002）、CCR2（p=0.004）、CCR5（p=0.046）表达高于MHCC97-L。趋化因子及受体基因芯片结果表明四组不同肺转移潜能细胞系趋化因子及趋化因子受体表达谱存在显着性差异（p＜0.01）。基因芯片结果显示HCCLM3较MHCC97L上调超过2倍的基因有8个，较SMMC-7721表达上调超过2倍的基因有9个，下调超过2倍的基因有42个。MHCC97L细胞系较SMMC-7721表达上调超过2倍的基因有17个。基因芯片中检测的功能配体明确的18个趋化因子受体与RT-PCR受体谱结果比较，表达水平及趋势基本一致。CXCR1、孤儿受体RDC1、IL-8在HCCLM3中高表达且与随肝癌肺转移潜能增高表达升高。与此相反，CXCR4呈现相反的变化趋势。此外，基因芯片中MMP2、MMP7在HCCLM3中表达高水平。以上实验说明，高低肺转移潜能肝癌细胞系趋化因子及受体表达在mRNA水平及cDNA水平存在差异性表达，与肝癌细胞系差异性转移潜能相关。趋化因子IL-8，趋化因子受体CMKOR1（RDC1）、CXCR1表达水平高且与肝癌肺转移正相关，而趋化因子受体CXCR4的表达水平与肝癌肺转移潜能负相关。需要进一步进行相关受体的功能实验及临床验证。第二部分RDC1基因在人肝癌组织及不同肺转移潜能肝癌细胞系中表达的分析一．SDF-1配体CXCR4表达验证及功能分析目前，文献报道与肿瘤转移最多的趋化因子受体是CXCR4，多个研究表明其在肿瘤组织表达上调与转移潜能密切相关。CXCR4与RDC1定位于同一条染色体上相近的区带，基因有很大的同源性，且均为HIV病毒感染CD4+T淋巴细胞的协同受体。第一部分研究表明CXCR4在肝癌肺转移潜能增加时表达下调，而RDC1的表达却与原发性肝癌的肺转移潜能正相关，所以为了深入研究RDC1在肝癌肺转移中的作用，首先对文献报道最多的CXCR4进行表达和功能分析。本部分工作接着以人肝细胞癌高、低肺转移潜能细胞系MHCC97-H、MHCC97-L为研究对象，研究趋化因子受体CXCR4在肝细胞癌肺转移过程中的功能和意义。实验通过RT-PCR和Western Blotting比较MHCC97-H、MHCC97-L细胞系CXCR4 mRNA及蛋白质水平的表达。CXCR4配体SDF-1α及肺提取物趋化实验和抗体抑制实验观察SDF-1α和裸鼠肺组织匀浆液对MHCC97-H的趋化迁移作用。结果表明，趋化因子受体CXCR4在MHCC97-H细胞系表达低于低肺转移潜能细胞系MHCC97-L，蛋白质水平与mRNA水平一致。SDF-1α对MHCC97-H趋化实验表明在1 ng／ml至100 ng／ml浓度范围内均有趋化作用，在浓度为50ng／L时趋化作用最显着（p＜0.05）。肺提取物亦发现对MHCC97-H有趋化作用，作用强于MHCC97-L及DMEM组（p＜0.05）。但加入CXCR4抗体后其趋化作用并未明显下调。以上实验说明，CXCR4在肝癌细胞表达并可能参与肝癌肺转移的过程，但并非肝癌细胞趋化转移的主要受体分子。二．RDC1 mRaNA水平及蛋白水平验证结合本课题第一部分的研究结果，本部分实验进一步验证RDC1mRNA水平及蛋白表达水平。实验用实时定量PCR对不同肺侵袭转移潜能SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3肝癌细胞系分析RDC1基因的表达差异。Western Blotting验证蛋白水平差异。结果表明，HCCLM3 Ct值为22.58±0.29，相对GAPDH值为（1.96±0.15）×10-3，比低转移潜能细胞系MHCC97-L(Ct值为23.57±0.40，相对GAPDH值为（1.12±0.22）×10-3)以及SMMC-7721(Ct值为28.08±0.48，相对GAPDH值为（0.13±0.10）×10-3)表达水平高，有显着的统计学差异（p＜0.01）。从MHCC97-L到HCCLM3，随着其侵袭与转移潜能的逐步提高RDC1表达水平也相应逐步升高。RDC1蛋白质表达水平与mRNA表达水平基本一致。以上实验表明，RDC1在高肺转移恰能肝癌细胞系高表达，且其表达水平与肝癌细胞侵袭性呈正相关。三．临床组织芯片验证筛选的趋化因子及受体本部分工作利用临床标本验证筛选得到的趋化因子IL-8及趋化因子受体RDC1、CXCR1及CXCR4与肝癌肺转移的关系，以及与肝癌患者术后3年生存关系。根据肝癌研究所随访资料术后有无肺转移情况，收取2000年1月至2004年7月临床行肝癌根治性切除术116例患者癌组织和46例癌旁组织，制备组织芯片。SABC免疫组化方法检测IL-8、RDC1、CXCR1及CXCR4表达。CrossTab分析比较3年生存率，Kaplan-Meier法分析RDC1、CXCR4、IL-8、CXCR1与肝癌患者3年累计生存关系。免疫组化结果表明四种被检测的蛋白主要染色于肿瘤细胞胞浆内，胞膜上亦可见染色。RDC1肺转移组患者原发灶RDC1表达高于未见肺转移的术后患者（p＜0.05），且肝癌组织表达明显高于癌旁组织表达（p=0.006）。此外，RDC1表达与肿瘤大小有关（p＜0.05），但与性别、肿瘤数目、癌栓、包膜完整性及TNM分期无统计学差异。肝癌原发灶白细胞介素-8（IL-8）在术后有肺转移组患者表达水平显着高于未发生肺转移组（P=0.018），但癌旁组织表达水平高于癌组织水平（p=0.10）。与RDC1相似，IL-8表达与肿瘤大小有关（p＜0.05），但与性别、肿瘤数目、癌栓、包膜完整性及TNM分期无统计学差异。CXCR4表达水平在术后肺转移组及未见肺转移组之间，病理特征以及临床分期均无统计学意义（p＞0.05）。癌旁组织表达高于原位肝癌组织表达（p=0.034）。与CXCR4相似，CXCR1表达水平在术后肺转移组及未见肺转移组之间，病理特征以及临床分期均无统计学意义（p＞0.05）。癌旁组织高于癌组织（p＜0.001）。四个检测蛋白癌旁组织在肺转移组患者和未见肺转移组患者间无统计学差异。RDC1低水平表达的患者（64％）较高水平表达组（51％）有更高的术后3年生存率。IL-8随表达增高3年生存率降低。IL-8低水平表达组患者累计生存高于高水平表达组（p=0.043），CXCR1低水平表达组患者累计生存低于高水平表达组（p=0.02），RDC1与CXCR4无统计学差异（p＜0.05）。以上实验提示肝癌患者RDC1表达与肺转移及肿瘤大小相关，且癌组织表达高于癌旁。IL-8与肝癌肺转移、肿瘤大小相关。肝癌患者IL-8高表达与术后3年生存预后相关，表达水平高的预后较差。RDC1表达与3年生存率有关，但表达水平对肝癌患者3年生存无明显预后作用。CXCR4表达与肺转移及术后3年生存预后均无相关性。第三部分RDC1基因RNAi体外及体内研究前两部分的实验表明，孤儿受体RDC1是与HCC肺转移密切相关的趋化因子受体，结合文献提示选择RDC1可能是参与原发性肝癌肺转移的主要受体分子之一，因而本部分实验选择RDC1作为进一步深入研究的对象具有重要的理论和临床意义。本部分实验利用RNA干扰技术下调高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3中RDC1基因表达，进一步观察RDC1对高转移肝癌细胞生长、血管生成、基质降解、侵袭能力以及体内肺转移行为的作用，初步研究RDC1参与肝癌肺转移的机制，并探索RDC1基因siRNA对肝癌肺转移的治疗效果。体外实验首先设计、筛选RDC1小干扰RNA，利用RNA干扰技术下调人高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3 RDC1基因表达，RT-PCR和Western Blotting验证干扰效果。然后利用细胞免疫荧光检测RDC1干扰后RDC1、CXCR4、白细胞介素-8（IL-8）、survivin表达改变。细胞免疫酶学检测RDC1干扰后骨桥蛋白（OPN）、血管内皮生长因子（VEGF）表达改变。RT-PCR检测RDC1干扰后OPN、survivin基因水平变化。明胶酶谱实验观察RDC1表达下调对肿瘤基质降解的影响。侵袭实验检测RDC1表达下调对HCCLM3侵袭潜能的影响。MTT增殖实验检测RDC1表达下调后对肝癌细胞增殖能力的影响。裸鼠实验观察RDC1干扰对肝癌生长和肺转移的作用。结果表明，针对RDC1基因设计的siRNA均有一定程度的干扰作用，RT-PCR及Western Blotting显示其中siRNA-286的干扰作用最强，可使靶基因下调至65％。当细胞转染密度为50％，siRNA与脂质体比例为1：2时转染效率最高。单次转染与多次转染无显着差异。细胞免疫荧光表明，RDC1干扰后可引起RDC1、IL-8、survivin表达水平下降，对CXCR4表达无显着影响。细胞免疫酶实验表明RDC1干扰引起OPN、VEGF表达水平的下降。RT-PCR表明RDC1表达下调引起OPN、survivin基因水平的下调。明胶酶谱分析表明，HCCLM3 RDC1干扰后24小时和48小时均可观察到RDC1干扰组基质金属蛋白表达的下调，且24小时强于48小时。侵袭实验表明，RDC1干扰组肿瘤细胞侵袭到底侧的数目减少（4±1个），而单纯脂质体组（8.3±1.53个）和Lipo组（10.3±1.53个）的肿瘤细胞具有较强的趋化侵袭能力，三组差别显着（p＜0.01）。MTT实验表明RDC1干扰组在72小时和96小时增殖能力开始下降，与对照组比较有显着差异（p＜0.01）。裸鼠实验表明，各组肝癌成瘤率100％。预干扰组瘤重（1.20±0.75g）低于无干扰组（3.02±1.68g）（p=0.036），预干扰+静脉组（1.18±0.77g）瘤重也低于无干扰组（p=0.035）。预干扰+瘤内组（2.27±1.03g）瘤重低于无干扰组（3.02±1.68g），但两组间无统计学差异。预干扰组体积（372.83±265.02mm3）低于无干扰组（1265.42±900.01mm3）（p=0.046），预干扰+静脉组体积（355.42±383.10mm3）也低于无干扰组（p=0.042）。预干扰+瘤内组体积（940.58±593.89mm3）低于无干扰组（1265.42±900.01mm3），但两组间无统计学差异。无干扰组发现肺转移灶100％，平均计数8.0±2.8个，预干扰组有4只裸鼠发现肺转移灶（4／6），平均计数2.5±2.0个，低于无干扰组（p＜0.01）；预干扰+静脉组有3只发现肺转移灶（3／6），平均计数2.3±2.2个，明显低于无干扰组（p＜0.01）。预干扰+瘤内组有5只裸鼠发现肺转移灶（5／6），平均计数6.3±3.6个，较预干扰组少，但无统计学差异（p＞0.05）。以上体内及体外实验提示，RDC1基因下调后肝癌侵袭转移潜能下降，RDC1基因可通过促进肝癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，增强细胞外基质降解，促进血管生成等作用参与原发性肝癌的生长和转移。此外，下调RDC1基因表达水平可引起体内肿瘤生长抑制及肺转移能力的下降，RDC1是潜在的治疗原发性肝癌肺转移的靶标。结论1．高低转移潜能肝癌细胞系趋化因子及受体在mRNA水平及cDNA水平存在差异性表达，与肝癌细胞系转移潜能差异性相关。趋化因子IL-8，趋化因子受体CMKOR1（RDC1）、CXCR1表达水平高且与肝癌肺转移正相关，而趋化因子受体CXCR4的表达水平与肝癌肺转移潜能负相关。2．CXCR4在肝癌组织及细胞表达并可能参与肝癌肺转移的过程，但并非肝癌细胞趋化转移的主要受体分子。3．RDC1在高转移潜能肝癌细胞系高表达，且其表达水平与肝癌细胞侵袭性呈正相关。4．RDC1与白细胞介素-8（IL-8）表达水平升高与临床肝癌患者肺转移相关。5．RNA干扰下调RDC1表达后通过促进肿瘤细胞增殖，抑制凋亡，增强基质降解，促进微血管生成等作用参与HCCLM3肝癌细胞肺转移行为。创新1．利用高低转移潜能人肝癌细胞模型，发现并证实了多个趋化因子及趋化因子受体参与原发性肝癌转移，为原发性肝癌选择性转移提供了理论及实验依据。2．首次发现并证实了趋化因子受体RDC1表达上调与原发性肝癌肺转移密切相关，是参与肝癌肺转移的重要肿瘤相关基因。3．利用RNA干扰技术探索性研究了RDC1参与原发性肝癌肺转移的机制，提出RDC1可能通过促进肝癌细胞增殖，抑制凋亡，促进基质降解以及微血管生成等作用促进原发性肝癌的生长和肺转移。4．探索了siRNA作为潜在的治疗肝癌肺转移的药物价值。潜在应用价值1．RDC1作为G蛋白偶联受体，由于其与HCC肺转移的密切关系，是潜在的临床原发性肝癌转移治疗的生物靶点。2．为深入研究肝癌侵袭转移的机制提供理论基础。
钟宁,马亚兵,高海青,张志勉,程梅,由倍安,伊永亮,刘新春[8]（2005）在《大蒜素抑制体外人肝癌细胞的侵袭能力》文中进行了进一步梳理目的:肝癌的侵袭与转移是导致其不良预后的重要因素,目前临床缺乏针对肝癌侵袭与转移的有效治疗措施. 本研究通过人肝癌细胞培养,研究大蒜素对体外人肝癌细胞侵袭能力的影响,并在基因水平上探讨其机制. 方法:将人肝BEL-7402细胞传代,取进入指数生长期的细胞随机分为阿霉素组Human（5 mg/L）、大蒜素低、中、高剂量组（25、50、100 mg/L）,另设空白对照. 处理后每30 min观察一次细胞转移相关超微结构,8 h 后用流式细胞术检测肿瘤侵袭转移抑制基因nm23-H1 和P2ras表达水平.数据用SAS 8.2软件进行X2检验. 结果:与阿霉素组相比,大蒜素处理后超微结构除凋亡表现外,大多数贴壁细胞胞质回缩,细胞之间的连接减少,空隙加大,细胞之间界限变清晰,表面的丝状微绒毛也明显减少.流式细胞检测显示,nm23-H1表达的荧光强度空白对照组为19.19,5 mg/L.阿霉素组为119.76,25 mg/L大蒜素组为84.28,50mg/L大蒜素组为92.64,100 mg/L大蒜素组为138.08,nm23-H1 表达与大蒜素呈明显剂量效应关系,大蒜素高剂量组比阿霉素组显着增强（138.08 vs 119.76,P<0.05）.而P21ras 表达的荧光强度在空白对照组、阿霉素组和低、中、高剂量组分别为2.65%、3.56%、1.55%、3.22%、3.44%,都表现为阴性低表达,各组间没有明显差别. 结论:大蒜素可以抑制体外肝癌细胞的侵袭能力,其机制可能与大蒜素特异性影响BEL-7402细胞袁面的微绒毛和上调肿瘤侵袭与转移抑制基因nm23-H1的表达有关.
田波[9]（2004）在《人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及转移机制的探讨》文中研究表明肝癌在我国是位列第二位的癌症“杀手”,占我国全部恶性肿瘤死亡人数的18.8%,占全世界肝癌死亡人数的 53%。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步,但总体而言,肝癌的预后并没有得到显着的改善,5 年生存率仍仅有 5%左右。术后复发转移是阻碍生存率进一步提高的最大的障碍。即使是根治性切除,术后 5 年内,仍有 60%70%的患者出现转移复发,而淋巴道转移也是肝癌最常见的转移表型之一。针对肝癌术后转移复发的研究是21 世纪肝癌研究重点。 肝癌的动物模型和细胞模型是肿瘤转移研究的重要基础和平台,现已建成了许多稳定的应用广泛的肝癌动物模型和细胞系,但绝大多数动物模型不发生转移,其中有明确的淋巴道转移潜能的人肝癌动物或细胞模型尚未见报道。肿瘤的转移是一个高度有序的、非随机的、器官特异性的过程,宿主微环境积极地参与了肿瘤细胞转移的全过程。目前,器官特异性转移的研究是肿瘤研究的热点之一,但其具体机制仍然不清楚。近来研究表明,趋化因子及其受体在肿瘤细胞迁移、侵袭和转移过程中有着重要的作用,发现了一些与特定肿瘤的器官特异性转移相关的趋化因子及其受体,为转移的防治提供了新的靶点和策略。但趋化因子及其受体在肝癌转移中的研究尚未见报道。 本课题应用连续体内筛选的方法,建立高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系HCCLYM,进而通过有限稀释法进行单克隆化,筛选高、低淋巴道转移潜能的单克隆细胞株 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L,并对其转移特性和基本生物学性状进行鉴定。具有人肝癌淋巴道转移模型体系的建立,为肝癌的淋巴道转移研究建立适宜的研究平台,也进一步丰富和完善本所的肝癌转移模型系统。应用分类基因芯片研究趋化因子及其受体在肝癌器官特异性淋巴道转移中的作用,寻找与肝癌的淋巴道器官特异性转移相关的趋化因子及其受体,并对其作用机制作初步的探讨。 第 一 部 分 人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及鉴定 本部分的研究目的是建立具有高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系,克隆分离 1<WP=5>博士论文 中文摘要具有不同淋巴道转移潜能的肝癌细胞株,并对其转移特性和基本生物学性状进行鉴定,为肝癌的淋巴道转移研究建立适宜的研究平台。 应用本所建立的具有多向高转移潜能的人肝癌细胞系 HCCLM6 为细胞母系,接种于裸鼠的爪垫部位,原代培养扩增转移淋巴结中的肝癌细胞,重新接种于裸鼠爪垫,连续 8 轮上述筛选,逐步扩增和纯化细胞母系中具有较高的特异性的淋巴道转移潜能的肿瘤细胞,建成具有高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系HCCLYM。 HCCLYM 细胞系肝脏原位移植淋巴结转移率为 83%,肺脏转移率为 40%;体外培养时为典型的多边形上皮样细胞,贴壁生长,接触性生长抑制丧失,细胞平均直径 38±2 微米,群体倍增时间 31.6 小时,克隆形成率 54±4%,亚三倍体核型,染色体数目范围 4568 条,主流染色体数目为 5660,占 78%,比较常见的标志性染色体有 i（X）（q10）,der（4）t（4;?）（q31;?）,Y 染色体缺如,并可见有同源染色区的标志性染色体;流式细胞检测细胞周期各时相的百分率分别为G0-G1 期 54.25%,S 期 25.56%,G2-M 期 10.45%,G2/G1 为 2.04;明胶酶谱法检测表明 HCCLYM 细胞可分泌大量 MMPs,其中以 MMP-2、MMP-9 及其活性型为主;PCR 法检测细胞基因组中有 HBV DNA 整合。 HCCLYM 细胞系采用有限稀释法单克隆化,得到 32 个单克隆细胞株,经过2 轮裸鼠体内筛选,挑选淋巴道转移潜能差别最大的两个单克隆,建株,命名为高、低淋巴道转移潜能人肝癌细胞株 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L。 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 单克隆细胞株肝脏原位移植淋巴结转移率分别为 100%和 30%,而肺转移率均为 30%。HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞平均直径分别为 37±4 微米和 38±5 微米;群体倍增时间分别为 30.3 小时和 32.3 小时;克隆形成率分别为 37±6%和 27±7%。流式细胞分析 HCCLYM-H 细胞株细胞周期各时相的百分率分别为 G0-G1 期 56.95%,S 期 29.93%,G2-M 期13.12%,G2/G1 为 2.04。而 HCCLYM-L 细胞株细胞周期各时相的百分率分别为 G0-G1 期 60.48%,S 期 27.03%,G2-M 期 12.49%,G2/G1 为 2.04。核型分析结果显示 HCCLYM-H 细胞株染色体数目范围 5360 条,主流染色体数目为5557,占 87%;而 HCCLYM-L 细胞株染色体数目范围 5058 条,主流染色体数目为 5356,占 83%;HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞株均可见标志性染色体 i（X）（q10）,der（4）t（4;?）（q31;?）,Y 染色体均缺如,但仅 HCCLYM-H 细胞株中可见同源染色区。图 1.10 为 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞株的代表核型。。两株细胞在体外培养时均可分泌基质金属蛋白酶,以MMP-2 、MMP-9及MMP-9的活性型为主,其中 HCCLYM-H 分泌 MMPs 的能力明显强于 HCCLYM-L。两克隆细胞株均可同基底膜组分 IV 型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白发生粘附, 2<WP=6>博士论文 中文摘要其中同 FN 的粘附能力最强,而 HCC
冀学宁,叶胜龙,李雁,田波,陈洁,刘银坤,汤钊猷[10]（2004）在《肺组织粗提物影响人原发性肝癌细胞侵袭转移机制的初步探讨》文中指出背景与目的:转移复发是原发性肝癌治疗失败的主要原因,而肺组织是原发性肝癌远处转移的好发部位。在小鼠不同组织粗提物诱导高转移潜能的人原发性肝癌细胞的体外趋化侵袭实验中,肺组织提取物具有最强的诱导能力。本研究旨在探讨小鼠肺组织粗提物促进人肝癌高转移细胞株移动侵袭的机制。方法:采用F型肌动蛋白聚合实验和流式细胞仪,分析C57BL/6小鼠肺组织粗提物诱导高转移潜能人肝癌细胞株MHCC97-H细胞骨架的变化。肺组织粗提物与MHCC97-H细胞孵育后,利用双重荧光染色分析F型肌动蛋白和基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9,MMP-9）表达的关系。结果:经无血清培养液或脾组织粗提物孵育后,MHCC97-H细胞呈梭型或多边形。与肺组织粗提物孵育后,随时间的增加,MHCC97-H细胞片层样或丝状伪足明显增多,流式细胞仪分析显示F型肌动蛋白在30s内增加1.9倍,激光扫描共聚焦显微镜观察MHCC97-H细胞F型肌动蛋白从细胞外周浓染到重新分布于细胞的导引侧。无血清培养基孵育MHCC97-H细胞后,MMP-9和F型肌动蛋白主要位于细胞的核周池;经肺组织粗提物孵育后,MHCC97-H细胞MMP-9和F型肌动蛋白则定位于细胞伪足的前端。结论:肺组织粗提物可能通过诱导MHCC97-H细胞形成伪足和改变MMP-9运送方式,从而促进MHCC97-H细胞移动侵袭?
二、肺组织粗提物影响人原发性肝癌细胞侵袭转移机制的初步探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肺组织粗提物影响人原发性肝癌细胞侵袭转移机制的初步探讨（论文提纲范文）
（1）复方叶下珠通过自噬降解Caveolin-1促进β-catenin泛素化失稳抑制乙肝相关性肝癌的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 肝癌现代医学研究现状 |
| 一、肝癌的流行病学 |
| 二、肝癌的病因及发病机制 |
| 三、肝癌西医治疗 |
| 四、HBV病毒感染与肝癌复发转移 |
| 第二节 肝癌中医研究现状 |
| 一、肝癌病名溯源 |
| 二、中医病因病机 |
| 三、肝癌的中医辨证分型 |
| 四、肝癌中医治疗现状 |
| 第三节 复方叶下珠的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 CP对乙肝相关性肝癌的增殖表型的作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第二节 CP对乙肝相关性肝癌细胞转移能力的作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第三节 CP降低乙肝相关性肝癌中β-catenin蛋白稳定性的研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第四节 CP网络药理学及乙肝相关性肝癌生物信息学研究 |
| 一、网络药理学及生物信息学研究主要数据库 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第五节 CP促进乙肝相关性肝癌细胞Cav-1自噬性降解的作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第六节 CP通过抑制Cav-1激活Akt/Gsk3β介导的β-catenin蛋白酶体降解途径的研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第七节 CP抑制乙肝相关性肝癌增殖转移的体内实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第三章 实验讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（2）全蝎与蜈蚣多肽粗提物抗乙肝病毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词英文注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 HBV病毒结构 |
| 1.1.1 HBV病毒颗粒 |
| 1.1.2 HBV病毒基因组 |
| 1.1.3 HBV病毒基因型 |
| 1.1.4 HBV感染的标志物 |
| 1.1.5 HBV病毒致病机制 |
| 1.1.6 HBV病毒临床治疗手段 |
| 1.2 全蝎与蜈蚣主要临床应用与药理作用研究 |
| 1.2.1 抗肿瘤 |
| 1.2.2 止痛 |
| 1.2.3 熄风止痉 |
| 1.3 全蝎与蜈蚣多肽研究进展 |
| 1.3.1 全蝎多肽 |
| 1.3.2 蜈蚣多肽 |
| 1.4 本课题的立题背景和意义 |
| 第二章 全蝎与蜈蚣药对的用药规律浅析 |
| 1 研究方法 |
| 1.1 处方来源 |
| 1.2 数据规范 |
| 2 结果 |
| 2.1 药物的性味归经统计 |
| 2.2 药物功效归类统计 |
| 2.3 药物频数统计 |
| 2.4 方剂的主治疾病统计 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 全蝎与蜈蚣多肽粗提物对肝癌细胞毒性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要试剂耗材 |
| 3.1.3 相关溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 多肽粗提物的制备 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 MTT细胞毒性实验 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 提取物多肽浓度测定 |
| 3.3.2 各样本重金属含量检测 |
| 3.3.3 PEST、PECH对 HepAD38 细胞存活率的影响 |
| 3.3.4 PEST、PECH对 HepG2 细胞存活率的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全蝎与蜈蚣多肽粗提物对HBV DNA复制的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要仪器设备 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.1.3 相关溶液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞上清收取 |
| 4.2.2 荧光定量PCR实验步骤 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 撤去四环素后的HBV DNA含量变化 |
| 4.3.2 HBV DNA标准曲线 |
| 4.3.3 各实验组对HBV DNA的抑制率 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全蝎与蜈蚣多肽粗提物对HBV表面抗原的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要仪器设备 |
| 5.1.2 主要试剂耗材 |
| 5.1.3 相关溶液的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞上清收取 |
| 5.2.2 HBsAg检测 |
| 5.2.3 HBeAg检测 |
| 5.2.4 统计学分析 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 各实验组对HBsAg、HBeAg水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全蝎与蜈蚣多肽粗提物对HBV基因表达的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 主要仪器设备 |
| 6.1.2 主要试剂耗材 |
| 6.1.3 相关溶液的配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞收取 |
| 6.2.2 引物设计 |
| 6.2.3 荧光定量PCR检测细胞内HBV基因的表达量变化 |
| 6.2.4 统计学分析 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 各实验组对HBV基因表达量的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全蝎与蜈蚣提取物对HBV core蛋白合成的影响 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 主要仪器设备 |
| 7.1.2 主要试剂耗材 |
| 7.1.3 相关抗体 |
| 7.1.4 相关溶液的配制 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 细胞收取与蛋白提取 |
| 7.2.2 SDS-PAGE胶配制 |
| 7.2.3 Western blot实验 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 各实验组对HBV Core蛋白表达量的影响 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 全文总结与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 本论文的创新点 |
| 8.3 存在问题 |
| 8.4 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
（3）双黄连组分中药干预结肠癌增殖和转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 赖氨酞氧化酶样蛋白-2在肿瘤中的研究进展 |
| 1. LOXL2概述 |
| 2. LOXL2与恶性肿瘤的关系 |
| 3. LOXL2与肿瘤微环境中成纤维细胞的关系 |
| 4. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 双黄连制剂的化学成分及药理作用研究进展 |
| 1. 双黄连制剂的化学成分研究 |
| 2. 双黄连制剂的临床及药理作用研究 |
| 3. 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 组织样本 |
| 2. 细胞系 |
| 3. 抗体 |
| 4. 试剂及耗材 |
| 5. 常用溶液及配制方法 |
| 6. 药物配制 |
| 7. 实验动物 |
| 8. 仪器设备 |
| 9. 公共数据库 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞实验 |
| 2. 分子实验 |
| 3. 动物实验 |
| 4. 生物信息学分析 |
| 5. 统计学分析 |
| 结果 |
| 1. LOXL2在结肠癌中的表达和临床意义 |
| 1.1 生物信息学分析LOXL2在结肠癌及其他恶性肿瘤中的表达情况 |
| 1.2 LOXL2在结肠癌组织样本中的表达情况 |
| 1.3 LOXL2在结肠癌组织中的表达与临床病理参数之间的关系 |
| 1.4 LOXL2表达水平与结肠癌患者临床预后的关系 |
| 2. LOXL2的表达水平与与肿瘤微环境中的成纤维细胞之间的关系 |
| 2.1 IHC染色观察结肠癌组织LOXL2表达与CAFs分布情况 |
| 2.2 R2:Genomics Analysis andisualization Platform数据库分析结肠癌组织中LOXL2与CAFs相关蛋白的表达相关性 |
| 2.3 LOXL2与CAFs的活化相关性研究 |
| 3. LOXL2激活的CAFs对结肠癌细胞迁移和侵袭行为的影响 |
| 4. 双黄连组分中药抗结肠癌的药效学及分子机制初探 |
| 4.1 双黄连组分中药抗结肠癌的最优配比研究 |
| 4.2 双黄连组分中药对结肠癌的体内抑制作用研究 |
| 4.3 双黄连组分中药对肿瘤微环境中CAFs的影响 |
| 4.4 双黄连组分中药对CAFs诱导的CT26细胞迁移和侵袭的抑制作用 |
| 4.5 双黄连组分中药抗结肠癌的分子机制初探 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）酪丝亮肽对肝癌肺转移的治疗作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、YSL对肝癌肺转移模型的影响 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2. 结果 |
| 1.2.1 肺表面大体转移灶结果 |
| 1.2.2 肺脏病理切片HE染色结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、YSL抗肝癌细胞侵袭能力的实验研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 肺组织粗提物诱导人肝癌细胞的侵袭能力实验研究 |
| 2.1.2 YSL对肝癌细胞侵袭能力的影响 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 肺组织粗提物诱导人肝癌细胞的侵袭能力实验 |
| 2.2.2 YSL对肝癌细胞侵袭能力的抑制作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 肺组织粗提物诱导人肝癌细胞的侵袭能力实验 |
| 2.3.2 YSL对肝癌细胞侵袭能力的抑制作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、YSL对金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9活性及表达影响的实验研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1. YSL对金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的蛋白活性的影响 |
| 3.1.2 YSL对金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平的影响 |
| 3.1.3 YSL对金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9 mRNA水平的影响 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 YSL对人肝癌细胞金属基质蛋白酶活性的抑制作用 |
| 3.2.2 YSL对金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平的抑制作用 |
| 3.2.3. YSL对金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9 mRNA水平的抑制作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（5）三维肝癌类组织体模型建立及肺侵袭关联蛋白筛查（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 新的高转移潜能肝癌类组织体模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肝癌肺侵袭模型建立及肺侵袭过程关联蛋白功能解析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 后续工作 |
| 附件 |
| 致谢 |
（6）常见人体肿瘤转移动物模型的建立及相关机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 不同免疫缺陷动物肿瘤原位移植模型生物学特性的比较 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 参考文献 |
| 第2章 肿瘤术后转移动物模型的建立 |
| 2.1 肝癌术后转移动物模型的建立 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.1.4 参考文献 |
| 2.2 肺癌术后转移动物模型的建立 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.2.4 参考文献 |
| 第3章 肿瘤转移相关机制的体内和体外实验研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 参考文献 |
| 结论 |
| 附录1:缩略语与中英文对照 |
| 附录2: 综述 |
| 在读期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）趋化因子受体表达与原发性肝癌肺转移关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 肝癌肺转移趋化因子受体表达谱分析及筛选 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RDC1基因在人肝癌组织及不同转移潜能肝癌细胞系中表达的分析 |
| 一.SDF-1配体CXCR4表达验证及功能分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 二.RDC1 mRNA水平及蛋白水平验证 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 三.临床组织芯片验证筛选的趋化因子及受体 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 RDC1基因RNAi体外及体内研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 趋化因子及受体与肿瘤转移 |
| 附件 |
| 致谢 |
（9）人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及转移机制的探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 趋化因子及其受体在人肝癌淋巴道器官特异性转移中的作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 论文声明 |
四、肺组织粗提物影响人原发性肝癌细胞侵袭转移机制的初步探讨（论文参考文献）
- [1]复方叶下珠通过自噬降解Caveolin-1促进β-catenin泛素化失稳抑制乙肝相关性肝癌的机制研究[D]. 黄丹萍. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]全蝎与蜈蚣多肽粗提物抗乙肝病毒研究[D]. 马青. 江苏大学, 2020(02)
- [3]双黄连组分中药干预结肠癌增殖和转移的机制研究[D]. 李城. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]酪丝亮肽对肝癌肺转移的治疗作用[D]. 孙亚军. 天津医科大学, 2012(04)
- [5]三维肝癌类组织体模型建立及肺侵袭关联蛋白筛查[D]. 唐建华. 复旦大学, 2010(02)
- [6]常见人体肿瘤转移动物模型的建立及相关机理研究[D]. 徐冰. 南方医科大学, 2007(03)
- [7]趋化因子受体表达与原发性肝癌肺转移关系的研究[D]. 薛同春. 复旦大学, 2007(06)
- [8]大蒜素抑制体外人肝癌细胞的侵袭能力[J]. 钟宁,马亚兵,高海青,张志勉,程梅,由倍安,伊永亮,刘新春. 世界华人消化杂志, 2005(06)
- [9]人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及转移机制的探讨[D]. 田波. 复旦大学, 2004(01)
- [10]肺组织粗提物影响人原发性肝癌细胞侵袭转移机制的初步探讨[J]. 冀学宁,叶胜龙,李雁,田波,陈洁,刘银坤,汤钊猷. 癌症, 2004(01)