核因子-κB对人眼小梁细胞生长及分泌功能影响的实验研究

论文摘要

背景及目的:小梁细胞位于前房角的小梁网组织中,含有多种细胞因子受体,能分泌基质金属蛋白酶（MMP）及细胞外基质（ECM）等多种成分,是维持小梁网结构及功能,保持房水外引流通畅的重要因素。小梁细胞功能障碍可导致房水外流阻力增大,眼压升高引发青光眼。研究发现原发性开角型青光眼患者的小梁细胞数量明显低于正常人,小梁网组织中ECM含量增加。因此,深入研究调节小梁细胞增殖、凋亡和分泌功能的分子机制,对明确青光眼的发病机制以及指导青光眼的治疗具有重要的意义。NF-κB是一个广泛存在于细胞中具有多向调节作用的核转录因子,在细胞生长分化、增殖、凋亡、免疫应答、炎症反应等生理及病理过程中发挥重要的调节作用。NF-κB的活化是炎症反应的中心环节,NF-κB的过度活化与许多急慢性炎性相关疾病的发生发展密切相关。在青光眼的发生、发展及临床治疗过程中,时常伴有炎症的发生,尤其是在外伤、葡萄膜炎所致的继发性青光眼的发病过程中,前房炎症反应所产生的大量炎症介质及细胞因子,必然会刺激小梁细胞NF-κB的活化。压力应激反应可导致细胞NF-κB的活化,研究发现原发性青光眼小梁网NF-κB的表达也明显高于正常人,而NF-κB的活化对青光眼的进程将会产生何种影响,目前仍不清楚。NF-κB的活化对细胞生存至关重要,NF-κB可通过直接调控与细胞增殖相关基因及抗凋亡基因的表达,参与细胞增殖与凋亡的调控。此外,NF-κB还可以调控多种基质金属蛋白酶的表达。临床上长期应用糖皮质激素可导致继发性青光眼的发生,而糖皮质激素是NF-κB的拮抗剂,长期应用激素使NF-κB活性被过度抑制,继而引发小梁细胞的凋亡是否是激素性青光眼的发病机制,目前亦尚不清楚。为此,本研究拟以NF-κB为切入点,通过培养人眼小梁细胞,将NF-κB的活性亚基P65/RelA基因转染入小梁细胞,观察NF-κB在小梁细胞中的过度表达对小梁细胞的增殖、凋亡,以及基质金属蛋白酶和TIGR基因转录和表达的影响。另一方面,采用圈套策略,即应用与NF-κB顺式作用元件序列同源的寡核苷酸序列抑制小梁细胞NF-κB的活化,观察其对小梁细胞增殖、凋亡,以及基质金属蛋白酶和TIGR基因的表达变化的影响。本课题试图阐述NF-κB在小梁细胞功能障碍中的作用,了解NF-κB在不同活性情况下对小梁细胞的影响,讨论其与青光眼发生的可能性。材料方法:人眼小梁细胞原代培养及鉴定:利用角膜移植术的供体眼组织,应用组织块培养法培养小梁细胞,采用免疫组化SP法,进行纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原、TIGR蛋白及Ⅷ因子相关抗原鉴定。细胞分组:采用培养在三到五代的小梁细胞进行实验,随机分为5组,正常对照组（C）,空质粒对照组（P65-C）,P65质粒组（P65）,随机圈套对照组（ODN-C）,NF-κB圈套核苷酸组（ODN）P65质粒及NF-κB圈套核苷酸细胞转染:采用脂质体转染方法,利用荧光显微镜及Westem Bolt法检测转染效果。P65质粒转染后小梁细胞培养液TNF-a含量检测:转染后24小时用ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量。NF-κB对小梁细胞增殖及凋亡的影响:分别应用MTT及3H-TdR掺入实验检测小梁细胞的增殖情况,用Tunel法检测小梁细胞的凋亡。NF-κB对小梁细胞基质金属蛋白酶（MMP）及其抑制剂（TIMP）表达的影响:应用RT-PCR方法检测小梁细胞MMP-1,MMP-2,MMP-3及TIMP-1,TIMP-2 mRNA的表达情况。NF-κB对小梁细胞TIGR基因表达调控的影响:应用RT-PCR及Western Blot法分别检测TIGR基因mRNA及蛋白质表达。结果:人眼小梁细胞培养成功,免疫组化鉴定LN、FN、Ⅳ型胶原及TIGR基因表达为阳性,Ⅷ因子相关抗原为阴性。P65质粒转染后24小时,小梁细胞P65的表达明显升高,细胞培养上清液中TNF-α含量显著升高。P65高表达抑制小梁细胞的增殖及DNA合成,促进小梁细胞凋亡增加。NF-κB圈套核苷酸同样抑制小梁细胞的增殖及DNA合成,并且促进小梁细胞凋亡的增加。P65高表达促进小梁细胞MMP-1及MMP-3 mRNA的表达,对MMP-2及TIMP-1,TIMP-2的表达无影响。NF-κB圈套核苷酸抑制小梁细胞MMP-1及MMP-3 mRNA的表达,对MMP-2及TIMP-1,TIMP-2的表达无影响。P65高表达抑制小梁细胞TIGR基因mRNA及蛋白质的表达,NF-κB圈套核苷酸促进小梁细胞TIGR基因mRNA及蛋白质的表达。结论:P65促进小梁细胞分泌炎症介质TNF-α,提示NF-κB过度活化可引发小梁细胞出现过度炎症反应。P65在小梁细胞中的过度表达抑制小梁细胞的增殖及DNA合成,并且促进小梁细胞凋亡的发生。提示前房过度炎症反应可能影响小梁细胞的存活,炎症继发性青光眼的发生可能与NF-κB过度活化密切相关。NF-κB圈套核苷酸抑制小梁细胞的增殖及DNA合成,并且促进小梁细胞凋亡的发生,说明NF-κB在正常情况下具有维持小梁细胞数量及功能平衡的作用。提示NF-κB活性过度受抑可能是糖皮质激素性青光眼的发生机制之一。NF-κB活化可促进小梁细胞MMP-1及MMP-3的表达,抑制NF-κB的活化则会抑制小梁细胞MMP-1及MMP-3的表达,说明NF-κB在调控小粱网细胞外基质平衡机制中占有重要的地位。提示长期应用NF-κB抑制剂,可能会导致小梁细胞MMP-1及MMP-3的分泌下降,造成小梁网ECM的过度堆积。NF-κB的活化和抑制可促使小梁细胞TIGR基因表达改变,说明NF-κB对青光眼相关基因TIGR的表达具有反相调控作用。提示NF-κB功能受抑可能是激素性青光眼小梁网TIGR蛋白表达增高的原因之一。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 核因子-κB对人眼小梁细胞生长及分泌功能影响的实验研究
• 前言
• 第一部分 小梁细胞培养及鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 NF-κB对小梁细胞增殖及凋亡的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 NF-κB对小梁细胞基质金属蛋白酶及基质金属蛋白酶抑制剂的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 NF-κB对小梁细胞TIGR基因表达调控的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 文献综述一 核因子-κB与眼科疾病的研究进展
• 参考文献
• 文献综述二 靶向核因子-κB的圈套核苷酸策略在疾病研究中的应用
• 参考文献
• 在读期间发表的论文