不同亚型猪流感病毒HA1重组蛋白的制备及H5亚型猪流感抗体ELISA检测技术研究

论文摘要

将H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型猪流感病毒（SIV）接种9-11日龄SPF鸡胚,收集24h-96h死亡鸡胚的尿囊液,测定病毒血凝效价;经2%甲醛37℃灭活48h并浓缩,制备了猪流感免疫抗原;选取无SIV感染的健康猪进行免疫,分别制备了抗H1、H3、H5和H9亚型SIV阳性血清250-300ml,HI效价达1/640。根据H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型SIV的HA基因序列设计特异性引物,以RT-PCR从病毒尿囊液中扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型SIV浙江株HA1基因,分别克隆到pET-28a（+）和pET32a（+）原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-HA1/H1、pET28a-HA1/H3、pET32a-HA1/H3、pET28a-HA1/H5、pET32a-HA1/H9;将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,pET28a-HA1/H1、pET28a-HA1/H3、pET32a-HA1/H3、pET28a-HA1/H5、pET32a-HA1/H9,在大肠杆菌中成功表达His-HA1/H1（45kDa）、His-HA1/H3（45kDa）、Trx-His-HA1/H3（58 kDa）、His-HA1/H5（45kDa）和Trx-His-HA1/H9（56kDa）融合蛋白,表达蛋白均可被抗His单克隆抗体和相应亚型猪流感阳性血清特异识别,表明融合蛋白具有良好的免疫学活性。诱导表达条件优化结果表明,诱导菌体OD600=0.3-1.0、0.1mM IPTG、37℃诱导4h为最佳表达条件;可溶性分析显示表达蛋白主要以不溶性包涵体形式存在。采用咪唑竞争结合法在变性条件下以Ni-NTA亲和纯化重组蛋白,以BCA法测定重组蛋白浓度,测得表达蛋白的产量分别为:18mg/L（pET28a-HA1/H1）、15mg/L（pET28a-HA1/H3）、10mg/L（pET32a-HA1/H3）、15mg/L（pET28a-HA1/H5）、12mg/L（pET32a-HA1/H9）培养物。用纯化的H5亚型SIV HA1重组蛋白作为检测抗原,建立了检测SI抗体的间接ELISA方法,并确定了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为0.31μg/孔,包被液为0.05M Tris-HCl缓冲液（pH8.5）;待检血清稀释度1:100;封闭液为5%脱脂奶,样品稀释液为含0.1%BSA、0.05%吐温-20的磷酸缓冲液;待检血清反应条件为37℃45 min,二抗为37℃30 min,底物溶液显色条件为37℃显色10min。特异性试验表明:上述ELISA方法特异检出H5亚型SIV抗体,与H1、H3或H9亚型SIV,以及猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等相关猪病阳性血清无交叉反应。重复性试验结果显示:同批抗原制备的不同检测板的批内变异系数（CV）值在2.6-14%之间,不同批抗原制备的检测板的批间CV值在19%以下。对临床猪血清的检测表明,ELISA方法与血凝抑制试验（HI）的阳性符合率为75.0%,阴性符合率为81.9%,总符合率为81.4%。ELISA方法对人工免疫猪流感抗体消长规律的检测结果也与HI相符,表明所建立ELISA方法能够检测抗体动态变化,为SIV的诊断与抗体监测提供了一种理想的技术手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 猪流感概述
• 1.1 猪流感的历史与世界流行情况
• 1.2 病毒形态结构与编码的蛋白
• 1.2.1 病毒的形态结构
• 1.2.2 病毒的编码蛋白
• 1.2.3 病毒的变异
• 2 猪流感诊断技术
• 2.1 流感病毒的分离和鉴定
• 2.2 猪流感的血清学诊断方法
• 2.3 猪流感的分子生物学诊断方法
• 3 猪流感的公共卫生意义
• 3.1 猪流感的兽医公共卫生意义
• 3.2 猪流感的人类公共卫生意义
• 4 小结
• 第二部分 研究内容
• 第一章 抗猪流感病毒血清的制备
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 实验动物
• 1.3 生化试剂
• 2 方法
• 2.1 病毒培养
• 2.2 血凝试验
• 2.3 免疫抗原的制备
• 2.4 动物免疫
• 2.5 抗体检测
• 2.5.1 血清采集
• 2.5.2 RDE处理血清
• 2.5.3 HI试验
• 2.6 抗猪流感病毒血清的收集
• 3 结果
• 3.1 猪流感免疫抗原
• 3.2 免疫猪抗体水平监测
• 3.3 抗猪流感病毒阳性血清
• 4 讨论
• 第二章 不同亚型猪流感病毒血凝素蛋白表达与纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒
• 1.2 菌株及质粒
• 1.3 酶与生化试剂
• 1.4 常用缓冲液
• 1.5 RT-PCR引物设计
• 1.6 病毒总RNA的抽提
• 1.7 cDNA第一链合成
• 1.8 HA1基因的PCR扩增
• 1.9 HA1基因原核表达构建
• 1.10 融合蛋白的表达和检测
• 1.11 重组蛋白的纯化
• 2 结果
• 2.1 HA1基因的扩增
• 2.2 重组质粒的构建
• 2.3 HA1蛋白的诱导表达与鉴定
• 2.3.1 重组表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.3.2 重组蛋白的Western blot鉴定
• 2.3.3 表达条件优化
• 2.4 表达蛋白的纯化
• 3 讨论与小结
• 第三章 检测猪H5亚型猪流感抗体的间接ELISA方法建立
• 1 材料与方法
• 1.1 血清
• 1.2 ELISA抗原
• 1.3 其它试剂与仪器
• 1.4 常用缓冲液
• 1.5 ELISA的操作基本程序
• 1.6 间接ELISA最佳反应条件的建立
• 1.6.1 抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
• 1.6.2 包被液的选择
• 1.6.3 封闭液的选择
• 1.6.4 稀释液的选择
• 1.6.5 血清最佳反应时间的确定
• 1.6.6 酶标抗体反应时间的确定
• 1.6.7 TMB底物反应时间的确定
• 1.7 间接ELISA判定标准的确定
• 1.8 交叉反应
• 1.9 同批抗原包被板内重复性试验
• 1.10 不同批次抗原包被板间重复性试验
• 1.11 血清样品检测
• 1.12 免疫猪抗体水平检测
• 1.12.1 HI试验
• 1.12.2 全病毒-ELISA
• 1.12.3 HA1-EL15A
• 2 结果
• 2.1 间接ELISA最佳反应条件的建立
• 2.1.1 抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
• 2.1.2 包被液的选择
• 2.1.3 封闭液的选择
• 2.1.4 稀释液的选择
• 2.1.5 血清最佳反应时间的确定
• 2.1.6 酶标抗体反应时间的确定
• 2.1.7 TMB底物反应时间的确定
• 2.2 间接ELISA判定标准的确定
• 2.3 间接ELISA特异性
• 2.4 间接ELISA稳定性和重复性试验
• 2.4.1 同批抗原包被板内重复性试验
• 2.4.2 不同批次抗原包被板间重复性试验
• 2.5 送检猪血清的检测
• 2.6 猪流感免疫猪抗体水平变化规律
• 3 小结与讨论
• 参考文献（REFERENCES）
• 常用缓冲液及培养基配方
• 英文缩略词表
• 致谢
• 个人简历