砂梨离体再生体系的建立及转chit42基因的研究

论文摘要

梨（Pyrus spp.）是中国主栽果树之一,栽培历史悠久,分布遍及全国。梨果色、香、味、质俱佳,很受消费者欢迎,在果品市场占有重要地位。砂梨（Pyrus pyrifoliaNakai）品种具有早实性、抗热性较强等特点,近年来南方栽培面积逐渐扩大,产量和品质逐年提高,但现有砂梨品种抗病性不强,特别是抗真菌性病害较弱的缺点在南方高温多湿的气候条件下表现得更为突出、因此,提高砂梨品种抗病能力是当前梨果实生产中亟待解决的问题。随着现代生物技术的发展及植物转基因技术的日趋成熟,使得通过生物工程方法培育具有优良性状的果树新品种成为可能。为此,本研究以我国南方主要栽培品种黄金梨和桂冠梨为试验材料,以期建立砂梨叶片再生体系,并在此基础上以chit42为外源基因进行黄金梨转化试验,构建黄金梨叶片遗传转化体系。主要研究结果如下:1.以黄金梨、桂冠梨离体叶片、茎段为试材,研究了不同的基因型、外植体、接种方式、不同时间的暗培养、NAA和6-BA的浓度配比对离体叶片和茎段再生不定梢的影响,以及不同的培养基,IBA浓度对不定梢的生根的影响。结果表明,黄金梨的叶片较桂冠的叶片再生能力强,而茎段再生能力较弱;叶片接种方式以远轴面向上为宜,茎段接种以横插入培养基为好;15d的暗培养是诱导叶片再生不定芽和梢的必要条件。诱导叶片再生不定梢的最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA2.0mg/L,诱导不定梢生根的最佳培养基为1/2MS+IBA3.5mg/L。2.对黄金梨叶片再生不定梢、不定梢再生不定根不同时期的叶片和根进行扫描电子显微镜观察,结果表明,叶片在试验的10d出现了愈伤组织,在15d左右即出现了类分生组织结构,在40d左右形成了不定梢,在80d时可看到发育完好的不定梢,但是最终形成的梢的数量远少于发生的梢的数量,而发生的梢的数量也远少于所形成的分生组织的数量。不定根的发生数量较多,不定根的数量和形成的类分生组织的数量相差不大。3.通过Cef对黄金梨叶片愈伤组织诱导及不定梢的分化的影响实验以及叶片对Kan抗性预备实验,基本确定遗传转化体系中抗生素最佳使用浓度为Cef 300mg/L、Kan75mg/L。4.以黄金梨叶片为农杆菌介导的转化受体,研究了不同外植体预培养时间、农杆菌的菌液浓度和共培时间对转化的影响,结果表明,当外植体预培养2d,农杆菌菌液OD600值为0.6时,共培养时间为3d时转化较好,最后得到抗性芽4个,PCR检测初步表明:其中有两个为阳性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1 梨再生体系组成
• 1.1 胚胎培养再生体系
• 1.2 愈伤组织再生体系
• 1.2.1 茎尖培养
• 1.2.2 芽、茎段培养
• 1.2.3 叶片培养
• 1.3 原生质体再生体系
• 1.4 生殖细胞再生体系
• 2 梨遗传转化研究进展
• 2.1 影响梨遗传转化体系的因素
• 2.1.1 基因型
• 2.1.2 农杆菌的侵染力
• 2.1.3 抗生素的种类、浓度及标记基因的选择
• 2.2 转化后的检测方法
• 2.3 存在的问题及展望
• 3 本研究的目的意义及主要内容
• 第二章 砂梨叶片再生不定梢的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 仪器设备
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 培养基的制备
• 1.2.2 外植体的消毒灭菌
• 1.2.3 接种方式对叶片诱导愈伤组织的影响
• 1.2.4 暗培养时间对叶片再生不定梢的影响
• 1.2.5 不同激素对黄金梨叶片诱导再生不定梢的影响
• 1.2.6 不同培养基和不同激素对生根的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 不同基因型和外植体再生能力的比较
• 2.2 接种方式对叶片再生不定梢和褐化的影响
• 2.3 暗培养对叶片再生的影响
• 2.4 6-BA与NAA组合对叶片、茎段再生不定梢的影响
• 2.5 不同培养基和不同的IBA激素浓度对生根的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 黄金梨叶片不定梢和不定根再生过程的扫描电镜观察
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 仪器设备
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 药剂的配制
• 1.2.2 扫描电子显微镜样品制作及观察
• 2. 结果与分析
• 2.1 不定梢的电镜观察
• 2.2 不定根的电镜观察
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 砂梨叶片遗传转化体系的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 质粒和菌株
• 1.1.3 试验用培养基
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 Cef对叶片愈伤组织的诱导及不定芽的分化的影响试验
• 1.2.2 Kan的抗性预备试验
• 1.2.3 农杆菌的转化和不定梢的再生
• 1.2.4 检测
• 2 结果与分析
• 2.1 Cef对黄金梨叶片愈伤组织的诱导及不定梢的分化的影响
• 2.2 Kan对黄金梨叶片诱导愈伤组织的影响
• 2.3 农杆菌的菌液浓度对转化的影响
• 2.4 共培时间对转化的影响
• 2.5 外植体预培养对转化的影响
• 2.6 转基因不定梢的获得
• 2.7 CTAB法提取DNA的结果
• 2.8 PCR检测结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 全文总结和展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介