糖基化终产物对大鼠海马小胶质细胞活化及炎症因子表达的体内外实验研究

论文摘要

[研究背景]阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种以进行性认知障碍为主要表现的神经系统变性疾病,是老年人痴呆最常见的病因。其主要病理三大特征为老年斑、神经元纤维缠结和小胶质细胞激活为中心的炎症反应。AD的发病机制很复杂,尚不完全清楚,近来研究发现阿尔茨海默病不同发病环节,即异常神经递质含量、过多的中枢神经系统氨基酸含量、过强的免疫炎症反应、细胞因子过度表达、淀粉样β蛋白沉积和tau蛋白异常磷酸化、神经元代谢异常、自由基产生和氧化应激损伤等和被激活的小胶质细胞有联系。目前认为神经小胶质细胞的活化引起脑内慢性炎症反应可能是AD发病的核心病理机制之一。糖基化终产物（advanced glycation end products, AGE）是还原糖与蛋白质的氨基通过一系列复杂的非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物。已有研究发现AGE可以通过对老年斑进行修饰,激活邻近的小胶质细胞和星形胶质细胞导致氧化应激和产生炎性细胞分子诱发AD早期的炎症反应。但AGE是否直接激活小胶质细胞引起炎性反应尚未见报道。因此,本研究在体内、体外水平上探讨AGE是否直接或通过作用细胞表面的受体诱导小胶质细胞活化及炎症因子的高表达。[目的]1.体内水平研究糖基化终产物对大鼠海马小胶质细胞活化及TNF-α、IL-1β、COX-2、p-NF-KB表达的影响。2.体外水平研究糖基化终产物对原代培养的小胶质细胞活化及分泌TNF-α、IL-1β、COX-2、NO的影响。3.探讨糖基化终产物诱导小胶质细胞激活引起的炎症反应在AD病理变化中的作用。[研究方法]30只Wistar大鼠随机分为正常对照组（control组）、BSA组、AGE-BSA组、AGE/RAGE-Ab组及RAGE-Ab组,每组6只。通过向大鼠海马区注射AGE-BSA,建立AD大鼠局部炎症病理模型。3周后采用Morris水迷宫实验检测大鼠认知行为学改变,免疫荧光组织化学法观察海马组织小胶质细胞标记物（CDllb）、星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的变化；免疫组织化学法及蛋白质免疫印迹法检测各组海马组织TNF-α、IL-1β、COX-2及P-NF-κB的蛋白表达。体外培养小胶质细胞,用AGE-BSA干预,用免疫细胞化学方法进行鉴定并观察其形态变化；用300μg/mL AGE-BSA激活和抗RAGE中和抗体阻断的方法对原代培养的小胶质细胞进行处理,经酶联免疫吸附法（ELISA）动态检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2及NO的水平。[研究结果]1.大鼠海马区注射AGE-BSA建立模型,与control组比较,AGE-BSA组大鼠逃避潜伏期明显延长,提示大鼠认知功能下降,免疫荧光组织化学检测发现海马区可见神经胶质细胞增生,以小胶质细胞为主；TNF-α、IL-1β、COX-2及P-NF-κB的表达明显增高（P<0.001）; AGE/RAGE-Ab组海马区小胶质细胞增生较AGE-BSA组明显减弱,TNF-α、IL-1β、COX-2及P-NF-κB表达也明显下调（P<0.01）,但仍高于NC组；NC组、BSA组、RAGE-Ab组TNF-α、IL-1β、COX-2及P-NF-κB表达差异不显著（P>0.05）2.原代培养的小胶质细胞经AGE-BSA干预后小胶质细胞胞体变大,形态不规则,呈“阿米巴样”,细胞上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2及NO浓度均明显升高（P<0.001）, AGE/RAGE-Ab组细胞上清液TNF-α、IL-1β、COX-2及NO浓度较AGE-BSA组呈明显下降趋势（P<0.01）,但仍高于control组（P<0.01）[结论]1.大鼠海马区注射AGE-BSA可诱导小胶质细胞增殖、活化,促进TNF-α、IL-1β、COX-2及P-NF-κB的蛋白表达增强。2. AGE-BSA可激活小胶质细胞,诱导其释放INF-α、IL-1β、COX-2及NO,并呈时间依赖性。3. AGE-BSA可直接或通过作用其受体（RAGE）激活小胶质细胞介导一系列免疫炎性反应,小胶质细胞炎症反应释放炎症介质介导神经毒性作用的发生,可损伤神经元,AGE可能参与AD发生的病理机制之一。[意义]本研究表明AGE-BSA可直接或通过作用细胞表面的RAGE激活小胶质细胞,促进大量炎症因子的表达,导致炎症反应。提示AGE诱导小胶质细胞激活引起的炎症反应可能参与AD的病理改变过程。由此推测AGE可能是导致AD脑组织慢性炎症反应的重要因素之一,该研究有助于揭示AD发病机制以及为以后的临床治疗提供新的靶点,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 糖基化终末产物对大鼠海马组织小胶质细胞活化及TNF-α、IL-1β、COX-2及p-NF-κB表达的影响
• （一） 材料与方法
• （二） 结果
• 第二部分 糖基化终末产物对大鼠原代小胶质细胞活化及分泌TNF-αIL-1β、COX-2及NO的影响
• （一） 材料与方法
• （二） 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
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