扇贝多肽抑制UVB诱导的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的研究

论文摘要

目的建立紫外线B（UVB）对体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的病理模型,探讨在UVB辐射下,扇贝多肽（PCF）抑制UVB诱导的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的作用机制。方法采用正交实验设计,以流式细胞仪PI染色法测定细胞凋亡率,采用45 mJ/cm2的UVB辐射体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞,确立凋亡的病理模型,实验分为六组:正常对照组、UVB模型组、UVB + 5.69 mM PCF组,UVB + 2.84 mM PCF组,UVB + 1.42 mM PCF组和UVB + 5.69 mM VitC组。首先研究PCF对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞后氧化还原状态的影响,UVB辐射后测定细胞抗羟自由基、抗超氧阴离子的水平、黄嘌啉氧化酶（XOD）和NADPH氧化酶活力;以2,7-二氯氢化荧光素二酯（DCFH-DA）为荧光探针,检测PCF对UVB照射后细胞内ROS生成的影响。其次,研究PCF对UVB诱导小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的线粒体通路和表面受体通路的影响,分别用Rhodamine 123和Fluo-3-AM荧光染色测定线粒体膜电位和细胞内游离钙的变化;免疫细胞化学检测细胞Bcl-xl和Bid基因蛋白的表达;流式细胞仪检测caspase-3的活性;western-blot检测线粒体细胞色素C（cytochrome c）的释放、FADD和caspase-8基因蛋白的表达;电镜分析PCF和caspase-8抑制剂（z-IETD-fmk）对UVB诱导的胸腺淋巴细胞凋亡的影响;RT-PCR检测Fas（CD95）mRNA的表达。最后,使用基因芯片技术分析PCF对UVB辐射后小鼠胸腺淋巴细胞基因谱的差异表达影响。Western-blot检测硫氧还蛋白（Trx）、蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt/PKB）的活性,预先加入或不加入PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002检测细胞凋亡信号调节激酶Ⅰ（apoptosis signal regulating kinase-1,ASK1）、JNK的活性、DNA ladder和线粒体膜电位（?ψМ）;免疫细胞化学检测细胞p53基因蛋白的表达;原位杂交检测细胞p38 mRNA、p21 mRNA的表达;RT-PCR检测c-fos mRNA和c-jun mRNA的表达;结果正交实验结果表明,45 mJ/cm2的UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞后2 h为最佳凋亡模型;在1.42 mM5.69 mM浓度范围内,PCF能提高抗羟自由基和抗超氧阴离子的水平,降低胸腺淋巴细胞中黄嘌啉氧化酶、NADPH氧化酶的活力和ROS的含量。PCF可调节线粒体通路和表面受体通路上凋亡相关分子的表达,稳定线粒体的膜电位,降低淋巴细胞内游离钙离子,使Bcl-xl蛋白表达升高而Bid蛋白表达降低;PCF抑制线粒体cytochrome c的释放,使caspase-3的活性降低;PCF可抑制表面受体通路上Fas mRNA、FADD和caspase-8基因蛋白的表达;当预先给予caspase-8抑制剂和PCF能够减轻UVB对细胞超微结构的损害。基因芯片结果显示,与模型组相比,PCF组有功能差异表达的基因共104个,其中上调基因56个,下调基因48个;western-blot结果提示,PCF能够提高小鼠胸腺淋巴细胞硫氧还蛋白的表达,激活AKT的活性,抑制ASK1-JNK/p38凋亡通路的活化。预先使用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002,DNA ladder片段增多,线粒体膜电位降低;此外,PCF可提高细胞周期相关基因p53蛋白的表达和p21 mRNA的表达;降低转录因子c-fos mRNA和c-jun mRNA的表达。结论:PCF能够改善由UVB辐射诱导的细胞氧化损伤,从根本上降低活性氧自由基的产生,是较好的海洋类抗氧化剂;PCF能够抑制线粒体凋亡信号通路和膜表面受体凋亡信号通路;提高抗氧化蛋白、细胞生存相关基因,抑制ASK1-JNK/p38凋亡通路的活化,抑制转录因子的表达,PCF通过调节细胞氧化还原、凋亡、信号转导、细胞周期、转录调节等众多基因的表达,起到抗氧化、抗凋亡、抑制UVB对小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的作用。上述结果表明,PCF是海洋类抑制UVB辐射的优质防护剂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 紫外线辐射诱导的活性氧信号转导作用靶标及作用机制研究进展
• 第一节 活性氧的种类、来源和清除
• 1 活性氧的种类
• 2 活性氧的来源
• 3 活性氧的清除
• 第二节 活性氧信号转导的作用靶标
• 1 ROS作用于细胞膜的靶标
• 1.1 受体激酶
• 1.2 磷脂酶和磷脂激酶
• 1.3 蛋白酪氨酸激酶／磷酸酶
• 2 ROS作用于细胞内的靶标
• 2.1 蛋白激酶C
• 2.2 丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）
• 2.3 磷脂酰肌醇酯-3激酶
• 2.4 细胞周期抑制剂p21
• 2.5 转录因子
• 2.6 DNA 分子
• 2.7 细胞色素C
• 2.8 钙离子
• 2.9 抗氧化蛋白酶
• 第三节 活性氧作用机制
• 1 改变细胞的氧化还原状态
• 2 对蛋白的氧化修饰
• 第二章 扇贝多肽的抗氧化作用研究
• 1 实验材料
• 1.1 试剂
• 1.2 试验动物
• 1.3 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 实验模型的建立
• 2.2 实验分组
• 2.3 试验项目及检测指标
• 3 统计学处理
• 4 实验结果
• 4.1 UVB辐射诱导小鼠胸腺淋巴细胞凋亡模型的建立
• 4.2 PCF对小鼠胸腺淋巴细胞抗羟自由基和抗超氧阴离子活力单位的影响
• 4.3 PCF对小鼠胸腺淋巴细胞黄嘌啉氧化酶（XOD）活力的影响
• 4.4 PCF对小鼠胸腺淋巴细胞NADPH氧化酶活力的影响
• 4.5 PCF对小鼠胸腺淋巴细胞ROS产生量的影响
• 5 讨论
• 第三章 扇贝多肽抑制UVB诱导的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的研究
• 1 实验材料
• 1.1 试剂
• 1.2 试验动物
• 1.3 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 流式细胞仪检测小鼠胸腺淋巴细胞线粒体膜电位
• 2.2 流式细胞仪检测小鼠胸腺淋巴细胞钙离子浓度
• 2.3 免疫细胞化学法测定Bcl-xl和Bid基因蛋白的表达
• 2.4 Western-blot检测细胞cytochrome c 的含量
• 2.5 流式细胞仪检测细胞caspase-3 的活力
• 2.6 RT-PCR检测Fas（CD95）mRNA的表达
• 2.7 Western-blot检测FADD及caspase-8 蛋白的表达
• 2.8 PCF和caspase-8 抑制剂对小鼠胸腺淋巴细胞超微结构的影响
• 3 试验结果
• 3.1 PCF对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞线粒体膜电位的影响
• 3.2 PCF对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞钙离子的影响
• 3.3 PCF对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞Bcl-xl和Bid蛋白表达的影响
• 3.4 PCF对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞cytochrome c 释放的影响
• 3.5 PCF对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞caspase-3 活力的影响
• 3.6 PCF对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞Fas（CD95）mRNA的影响
• 3.7 PCF 对 UVB 辐射小鼠胸腺淋巴细胞 FADD 及caspase-8 蛋白表达的影响
• 3.8 PCF和caspase-8 抑制剂对小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的抑制作用
• 4 统计学处理
• 5 讨论
• 第四章 扇贝多肽对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞基因谱表达的研究..
• 1 实验材料
• 1.1 试剂
• 1.2 试验动物
• 1.3 仪器设备
• 2. 实验方法
• 2.1 实验分组和模型建立
• 2.2 基因芯片技术检测小鼠胸腺淋巴细胞基因谱的表达
• 2.3 Western-blot 检测硫氧还蛋白、Akt、ASK1 和JNK蛋白的表达
• 2.4 PCF和PI3K/Akt通路抑制剂LY294002对DNA片段形成的影响
• 2.5 PCF和PI3K/Akt通路抑制剂LY294002对线粒体膜电位的影响
• 2.6 免疫细胞化学检测小鼠胸腺淋巴细胞p53 蛋白的表达
• 2.7 原位杂交检测小鼠胸腺淋巴细胞P21 mRNA和p38 mRNA的表达
• 2.8 RT-PCR检测小鼠胸腺淋巴细胞c-Fos和c-Jun mRNA的表达
• 3 统计学处理
• 4 实验结果
• 4.1 总RNA 提取结果
• 4.2 基因芯片结果
• 4.3 PCF对小鼠胸腺淋巴细胞中硫氧还蛋白表达的影响
• 4.4 PCF对小鼠胸腺淋巴细胞中Akt、ASK1 和JNK蛋白表达的影响
• 4.5 PCF和抑制剂LY294002 对小鼠胸腺淋巴细胞DNA片段形成的影响
• 4.6 PCF和抑制剂LY294002 对小鼠胸腺淋巴细胞线粒体膜电位的影响
• 4.7 PCF对小鼠胸腺淋巴细胞p53 基因蛋白表达的影响
• 4.8 PCF对小鼠胸腺淋巴细胞p21 mRNA和p38 mRNA表达的影响
• 4.9 PCF对小鼠胸腺淋巴细胞c-Fos mRNA、c-Jun mRNA表达的影响
• 5、讨论
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 中英文缩略词表
• 个人简历
• 发表的学术论文