高压氧治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤毒副作用的实验研究

论文摘要

研究背景：缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是由于脑组织供血不足引起的脑代谢变化导致的脑组织损害。尽管当今围产期监测、孕期和新生儿监护等方面的医疗技术取得了长足的发展，但近年来新生儿窒息和新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的发生率却无明显降低。据统计，在发达国家如美国，HIE发生率为平均为每1000个活产新生儿中2～4个，在发展中国家，发病率更高。早产儿HIE的发病率更高，其中10％～60％在新生儿期死亡。在存活的新生儿中，25％遗留下如脑瘫、精神发育迟滞、学习困难和癫痫等永久性的神经功能障碍（Spong，2005）。这部分留有终身残疾的病人，生活不能自理，给社会、家庭造成巨大的经济负担和精神压力。但是，目前的治疗仅局限于支持疗法，应用多种脑细胞活性药物促进其功能恢复，但对已经进入凋亡通路（可以挽救）的细胞以及缺氧缺血所致的脑瘫和其他类型的脑损伤方面却仍然显得束手无策。目前比较有前途的可用于治疗新生儿HIE的方法主要有三种：1)头部亚低温；2)高压氧（HBO）；3)干细胞移植。头部亚低温治疗新生儿HIE有一定近期疗效，但治疗窗较窄，一般要求在出生6小时内开始治疗，且对HIE的远期后遗症的改善效果不明显（Gluckman，2005），因此还难以在临床广泛推广。干细胞移植治疗HIBD目前仍主要处于动物试验的基础研究阶段。可用于移植治疗HIBD的干细胞主要包括骨髓、脐血、脂肪的干细胞和神经干细胞（NSCs）。临床应用干细胞移植治疗新生儿HIE仍存在供体来源、宿主移植物排异和医学伦理等棘手的问题。HBO治疗新生儿HIE已有数十年历史，但无论是实验还是临床研究的结果均存在着分歧。HBO对神经的保护机制仍然很不清楚。临床研究应用HBO治疗新生儿HIE的国外文献到目前为止仍然查阅不到。国内顾英芹1992年首次报道用HBO治疗30例新生儿HIE取得明显效果。以后，有关报道逐年增加，论文发表数量迅速增长，迄今发表文章已达500余篇。这些报道大多认为HBO治疗有效，可减轻神经系统症状、缩短病程及降低后遗症和死亡率。但也有不同结果的报道，认为HBO对HIE患儿的远期智力发育无改善作用（王家蓉，2005）。随着HBO治疗HIE的数量增多，HBO的安全性也显得更加突出。除了疗效存在争议外，目前对HBO治疗HIE的毒副作用方面更是认识不足。除减压病及气压伤等副作用外，HBO的毒副作用还可能包括氧中毒，包括眼氧中毒、肺氧中毒和脑氧中毒等。另外还可出现循环红细胞量减少，心肌传导阻滞，肝功能异常，急性肾小管坏死，胚胎致畸率增高，染色体畸变等（李温仁，1998）。还有个别报道可造成脑血栓形成、脑出血、气颅、气胸等并发征（杨莲荣，2002）。在20世纪50年代中后期，临床研究中发现过量用氧是导致早生儿视网膜病变（ROP）和支气管肺发育不良（BPD）一个重要原因。对于高氧引起ROP的机制目前仍有两种观点，一种认为吸入氧浓度越高、时间越长发病率越高（周丛乐，2003）另一种认为“相对缺氧”即高浓度给氧后迅速停止是主要原因，而与吸氧时间无关（Waldo E Nelson，张国成主译，1999）。按照第二种观点，HBO是ROP发生的一个原因。ROP主要发生于早产儿，HBO治疗是否可以也可导致HIE新生儿发生ROP呢?目前尚不清楚。氧自由基损伤（FRD）在HIBD发生发展中具有重要作用。目前大多数试验证实HBO可提高自由基清除酶类的活力，纠正HIBD发病中的异常脂质过氧化反应。但目前存在不同的意见，认为缺氧缺血后，HBO下氧自由基产生会增加，进一步加重脂质过氧化物形成和HIBD损伤（Demchenko，2002）。HBO治疗HIBD是否具有疗效，特别是是否会发生ROP、BPD以及脂质过氧化物增加等以上的毒副作用，目前结论不一。本试验从动物试验结合临床研究来进行验证HBO治疗HIBD的毒副作用。试验分为三个部分：一、高压氧对新生大鼠HIBD的保护作用、眼视网膜血管增生和肺的毒副作用的实验研究目的：探讨HBO治疗新生大鼠HIBD的脑保护作用、眼球视网膜血管增生情况及肺组织毒性作用。方法：新生7d的SD大鼠随机分为正常组（CON）、缺氧缺血模型组（HIBD）、高压空气组（HA）、高氧组（HO）、高压氧组（HBO）、高氧+高压氧组（2H）。动物每组16～36只。HA和HBO组于HIBD模型制作后2小时给予高压空气和高压氧（2.0 ATA）处理，每日1次，连续7日；HO组于HIBD制作后即给予高氧处理（氧浓度＞90％），连续7日；2H组于HIBD模型制作后进行高氧处理，同时每天进行1次HBO治疗，连续7日。各组处理7日后在常压空气中饲养7日，于21日龄时处死。进行脑组织海马CA1区细胞凋亡（TUNEL）检测、眼球切片视网膜新生血管芽细胞核计数、血管内皮细胞生长因子（VEGF）免疫组化和视网膜铺片、肺组织切片HE染色。用SPSS 10.0软件进行统计分析处理。结果：平均每个视野（每组12个视野）相同面积内脑组织海马CA1区凋亡细胞数为：CON组3±1个，HIBD组为156±21，HA组为135±14，HO组为137±15个，HBO组为7±2个，2H组为26±4个。和CON组相比，HIBD组、HA组、HO组凋亡细胞增多，差异有非常显著统计学意义，P＜0.01；HBO组及2H组差异无统计学意义，P＞0.05。平均每张切片（每组30张）视网膜新生血管芽细胞核计数为：CON组12.5±3.2个，HIBD组15.2±5.3个、HA组13.7±4.2、HO组159.2±13.5个，HBO组12.7±3.8个、2H组208.3±16.6个。与CON组相比，HIBD、HA、HBO组差异无统计学意义，P＞0.05；HO组和2H组新生血管细胞核增多，差异有非常显著意义，P＜0.001。视网膜铺片显示HIBD、HA、HBO组无明显血管增生现象，而HO和2H组视网膜血管明显增生。视网膜VEGF免疫组化可见HIBD、HA、HBO组有微弱表达，而HO和2H组则明显表达，差别有统计学意义，P＜0.001。肺组织HE染色光学显微镜下观察：HIBD、HA组和HBO组均与正常对照组没有明显差别，两组肺泡结构规整，肺泡大小较均匀，肺泡间隔较薄。而HO组肺泡样结构不规则，大量肺泡融合，肺泡数量减少，正常肺泡结构消失，肺间质少量胶原沉积及明显增厚。2H组比正常也有改变，但程度较高氧组为轻，肺泡间质增厚不明显。结论：HBO具有抑制HIBD新生大鼠脑组织细胞凋亡的作用，而高氧和高压无此种作用；高氧有刺激新生大鼠视网膜血管增生和肺组织损伤作用，HBO对新生大鼠无视网膜血管增生和肺组织损伤作用；高氧刺激视网膜细胞分泌VEGF增多，而HBO无此种作用。二、HBO对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织脂质过氧化物的影响目的：探讨HBO对HIBD脑组织脂质过氧化作用的影响。方法：新生7d的SD大鼠随机分组和处理方法同第一部分。于21日龄处死大鼠。在左侧脑组织（100mg）匀浆中，应用酶联免疫（ELISA）方法检测8-异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）含量的变化。8-iso-PGF2α是经氧自由基催化不饱和脂肪酸脂质过氧化后的稳定终末产物，其在体液和组织中存在极其稳定，含量不受饮食中脂质和药物等因素的影响，各种样本可以较长时间保存而不影响测定结果，是体内氧化应激的标志物，可以特异、准确地反映体内缺氧缺血-再灌注后的脂质过氧化程度的良好指标。实验结果采用均数±标准差（（?）±s）表示，用SPSS10.0软件进行分析处理。结果：平均每组8-iso-PGF2α含量为：CON组46.5±8.6pg／g，HIBD组166.8±26.2pg／g，HA组185.5±36.5pg／g，HO组417.6±58.5pg／g，HBO组184.5±42.3pg／g，2H组352.5±43.4pg／g。和CON组相比，HIBD、HA、HO、HBO和2H组脑组织中8-iso-PGF2α含量均显著增高，差异有非常显著统计学意义，P＜0.001，但从数值上可以看出，以HO组增高最为显著。和HIBD组比较，HA和HBO组差异无显著性意义，P＞0.05；HO组和2H组增高有显著性意义，P＜0.01。结论：HIBD后脑组织脂质过氧化物含量增加，在一定条件下，高压（HA）无进一步增加HIBD后脑组织内脂质过氧化物形成的作用；高氧（HO）可明显增加HIBD后脑组织内脂质过氧化物含量；HBO没有导致脂质过氧化物（8-iso-PGF2α）含量进一步增高的作用。三、HBO治疗新生儿HIE临床研究目的：探讨HBO治疗对HIE新生儿的预后影响。方法：48例HIE新生儿随机分为常规治疗组和HBO治疗组，其中对照组22例，HBO组26例。分别于1月龄、3月龄、6月龄、9月龄、1岁、1.5岁、2岁、2.5岁和3岁时作定期随访。进行体格发育、神经系统、视力（包括眼底）及听力检查。分别于1月龄、1岁和3岁时进行胸片和头颅CT和／或MRI检查。0～1月龄期间进行新生儿行为神经测定（NBNA），1月龄～3岁期间进行婴幼儿智能发育测验（CDCC）。结果用NBNA评分与智力指数（MDI）等表示。结果：2000年6月～2005年6月期间全国高压氧协作组单位共汇总纳入HIE新生儿48例。1月龄内进行的NBNA评分，治疗组HBO治疗前平均评分为32.2±2.4，HBO治疗一个疗程后平均为37.6±1.7，对照组治疗前为31.9±2.8，相应HBO治疗时间后为33.2±2.1，治疗后结果两组相比，差异有非常显著意义，P＜0.001。CDCC测验结果，治疗组MDI 6月龄时平均为102.6±10.5，1岁为106.5±12.2，2岁为105.8±13.8，3岁为113.6±13.4；对照组6月龄时为84.9±11.6，1岁为82.1±12.3，2岁为85.2±11.4，3岁为88.3±13.3。各年龄组之间比较，差异有非常显著性意义，P＜0.001。两组患儿的死亡率、癫痫及脑瘫发生率无明显差别，两组均未见有听力损害的病例。治疗组有1例患儿发生了白内障和青光眼，但无统计学意义。眼底视网膜检查、胸片检查两组均未见异常病例。结论：HBO有提高HIE新生儿近期及远期预后的作用，未见ROP及BPD的毒副作用，HBO是新生儿HIE一种安全有效的治疗方法。综上所述，本研究结论如下：1．HBO具有抑制HIBD新生大鼠脑组织细胞凋亡作用。2．高氧是导致视网膜血管增生的原因，而HBO对新生大鼠无视网膜血管增生和肺组织损伤作用。3．HBO没有进一步加重HIBD后脑组织脂质过氧化物作用。4．临床研究证实HBO具有提高HIBD新生儿近期和远期预后的作用，未见视网膜血管增生及支气管肺发育不良的毒副作用。5．HBO是新生儿HIBD一种安全有效的治疗方法。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 英文缩略词表
• 论文正文
• 第一部分 高压氧对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用、眼视网膜血管增生和肺的毒副作用的实验研究
• 1.前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二部分 高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织脂质过氧化物的影响
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 5.结论
• 第三部分 高压氧治疗新生儿缺氧缺血性脑病临床研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 5.结论
• 附:高压氧病例一览表
• 参考文献
• 综述 高压氧治疗缺氧缺血性脑损伤（病）研究进展
• 致谢
• 攻读学位期间主要成果