孤束核味觉区脑啡肽和γ-氨基丁酸对味觉信息的调制作用

论文摘要

孤束核吻侧段（rostral nucleus of the solitary tract,rNST）与味觉信息的传递及整合有密切关系。rNST不仅接受来自于面、舌咽及迷走神经的味觉传入,而且与味觉调控关系密切的核团（臂旁核、下丘脑、丘脑、中央杏仁核、味觉皮质等）之间具有往返的纤维联系。rNST内含有多种神经递质和调质。其中,谷氨酸和P物质主要发挥兴奋性调节作用,而脑啡肽（enkephalin,ENK）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）主要对味觉感受神经元产生抑制作用。rNST内分布有密集的ENK阳性（ENK-ir）纤维和终末及大量的μ型和δ型阿片受体（μopioid receptor,MOR和δopioid receptor, DOR）。GABA阳性（GABA-ir）神经元也大量存在于rNST内。Malanga等发现GABA的活性受到阿片类物质的抑制,而Echo等则证实阿片与GABA存在功能上的协同作用,但其作用机制的形态学基础目前仍未见报道。且孤束核内的GABA能神经元是否呈MOR阳性,这些尚都缺乏直接的形态学证据。为此,本研究利用脑立体定位仪并应用光、电镜免疫组织化学方法,对大鼠摄食变化及rNST内ENK-ir与GABA-ir结构之间的相互联系以及MOR-ir神经元与ENK-ir终末的联系进行了观察。第一部分孤束核内微量注射脑啡肽和γ-氨基丁酸引起大鼠摄食改变的行为学研究目的利用脑立体定位仪向孤束核内微量注射脑啡肽和γ-氨基丁酸,观察大鼠摄食变化。方法1.测量基础摄食量SD大鼠22只。分为三组,GABA组10只、ENK组10只和对照组2只。均单笼饲养在消毒后的笼子中,自由进水、饮食,室温22±2℃,12 h光照/黑暗转换。连续喂养5日,以适应环境。并测量累积摄食量。2.外科手术2.1用2%戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔麻醉后,将动物头部固定在立体定位仪上,根据Paxinos和Watson[Paxinos and Watson, 1999]图谱经颅骨在rNST将一带芯不锈钢导管（外径0.9mm）插入rNTS上方2.0 mm处（Bregma向尾段12.80mm,中线旁开1.2mm,Bregma点水平向下6mm。Bregma点是大鼠的前囟门位置）手术后,每天给予肌肉注射青霉素20万单位,连续四天,以防伤口和颅内感染。2.2脑内注射:动物轻微麻醉后,将一微量注射器针头（外径0.4 mm）经导管插入脑内,使其尖端在导管尖端下方2.0 mm处,以到达rNTS（Bregma向尾段12.80mm,中线旁开1.2mm,Bregma点水平向下8mm）。将0.2（每侧）μl的药物或生理盐水缓慢地注入rNTS。3.术后测量基础摄食量在注药后4小时、8小时、12小时按同一方法记录大鼠累积进食量。4.注射区的组织学定位实验结束时,在深度麻醉下,将动物用生理盐水和4%多聚甲醛液中相继经升主动脉进行灌注。取出脑并将其在4%多聚甲醛溶液中后固定1-2 d。用冰冻切片机切成大约60μm厚的切片,HE染色。然后将注射位点按组织学图谱进行组织学定位。结果1.注药部位检查:切片检查显示,rNST微量注射的部位（即针道的顶端）处于孤束核吻端内,双侧对称。2.GABA组10只,其中有1只出现了术后感染,弃去不用。从分别在注药后4小时、8小时、12小时测量摄食量,剩余9只与对照组相比,均出现摄食量降低。3.ENK组10只分别在注药后4小时、8小时、12小时测量摄食量,与对照组相比,均出现摄食量降低。结论分别向孤束核内微量注射GABA和ENK,均可引起大鼠基础摄食量降低,这主要是由于二者均可抑制孤束核内的味觉神经元活性,从而影响大鼠的基础摄食量。第二部分大鼠延髓孤束核吻侧段内脑啡肽阳性终末与γ-氨基丁酸阳性神经元联系的形态学研究目的观察大鼠孤束核吻侧段（rNTS）内脑啡肽阳性（ENK-ir）终末与γ-氨基丁酸阳性（GABA-ir）神经元之间的联系。方法1.组织材料的处理SD大鼠10只。将大鼠在腹腔内注射过量戊巴比妥钠（100 mg/kg）的深麻醉状态下开胸,经升主动脉插管,先用80 ml生理盐水冲净血液,再灌注以500 ml含4%多聚甲醛、0.05%戊二醛和2%苦味酸的0.1 mol/L磷酸缓冲液（PB,pH 7.4）。灌注完毕立即取脑并置于上述新鲜固定液中后固定4h,再移入含30%蔗糖的0.1 mol/L PB（4℃）内至沉底。将材料切块,分离出低位脑干并切片。2.免疫荧光染色法将光镜组切片置于含小鼠抗ENK（1:500）及兔抗GABA（1:5000）的反应液内（含5%正常山羊血清及0.5% Triton X-100）室温孵育24小时。之后浸入含Biotin标记的绵羊抗小鼠IgG（1:200）的反应液内于室温下孵育8小时。最后入含Texas Red标记的Avidin（1:200）及Fluorescein标记的驴抗兔IgG（1:200）反应液,室温下避光孵育6小时。将上述切片裱于载玻片上,使用SlowFade抗荧光衰减剂封片后于激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS-SP2）下观察。3.包埋前染色免疫电镜法电镜组切片在进行免疫组化染色之前,置于液氮中速冻数秒,放置前、后将切片浸于冰冻保护液中。将切片置于30%正常山羊血清中30 min,之后浸入含小鼠抗ENK（1:500）及兔抗GABA（1:5000）的反应液内（含5%正常山羊血清）,室温孵育24 h。随后浸入含Biotin标记的绵羊抗小鼠IgG（1:200）及纳米金标记的山羊抗兔IgG的反应液内,室温下过夜。在1%戊二醛内固定10 min后将切片用银加强试剂盒进行银加强染色,染色前后使用双蒸水清洗。之后使用ABC复合物孵育2 h并进行常规二氨基联苯胺（DAB）反应。上述各步骤之间均用PBS彻底清洗。随后将经上述免疫组化双重染色的切片置入1%锇酸溶液固定1 h,在70%酒铀中浸泡4 h,梯度酒精及环氧丙烷脱水,Epon-812平板包埋。取rNTS位置的组织片做超薄切片,枸橼酸铅染色后于电镜（H-7500,Hitachi）下观察。结果1.在激光共聚焦扫描显微镜下1.1 rNTS内分布着红色标示的ENK-ir结构,以密集分布的终末为主,阳性纤维呈中等密度分布。1.2 rNTS内分布着绿色标示的GABA-ir结构,以散在分布且直径为1015μm的小神经元为主,纤维和终末样结构则稀疏地分布于阳性胞体之间。1.3部分ENK-ir终末与GABA-ir胞体以及阴性的胞体（直径1035μm）之间形成密切接触。2.在电镜下2.1 rNTS内存在许多ENK-ir轴突和终末。在ENK-ir终末内,可见DAB反应产物主要沉积于圆形清亮囊泡表面及线粒体等细胞器表面,在部分终末内还可见到阳性的大颗粒囊泡。2.2 rNTS内存在GABA-ir结构,可见数目及大小不等的黑色金颗粒散在分布于胞体、树突及少量轴突内。GABA-ir产物主要分布于粗面内质网及核糖体表面等结构。2.3电镜下可见到ENK-ir轴突终末形成以下突触关系:2.3.1与GABA-ir阳性胞体、树突及树突棘形成对称（62%）及非对称性（38%）轴-体（26%）及轴-树（74%）突触。2.3.2与GABA-ir阴性的胞体、树突及树突棘形成对称（73%）及非对称性（27%）轴-体（18%）及轴-树（82%）突触;2.3.3与GABA-ir阴性的轴突之间还可见到少量对称性轴-轴突触,ENK-ir轴突终末为突触前或后成分。结论rNTS内的ENK-ir终末可能通过抑制或增强GABA能神经元活性或者直接抑制味觉感受神经元活性的方式参与NTS内味觉信息的感受和调节。第三部分大鼠延髓孤束核吻侧段内GABA和MOR共存神经元及ENK阳性终末与MOR阳性神经元联系的实验研究目的观察延髓孤束核吻侧段（rNST）内是否存在γ-氨基丁酸（GABA）与阿片μ受体（MOR）共存的神经元,以及MOR阳性（MOR-ir）神经元与脑啡肽阳性（ENK-ir）终末的突触联系。方法1.组织材料的处理SD大鼠22只。将大鼠在腹腔内注射过量戊巴比妥钠（100 mg/kg）的深麻醉状态下灌注,取材。方法同上。2免疫荧光染色法方法同上。光镜组第一套切片用豚鼠抗MOR（1:500）及兔抗GABA（1:5000）代替原一抗,用Fluorescein标记的驴抗豚鼠IgG（1:500）和Cy3标记的绵羊抗兔IgG（1:500）代替原二抗。光镜组第二套切片用小鼠抗ENK（1:500）及豚鼠抗MOR（1:500）代替原一抗,用Biotin标记的绵羊抗小鼠IgG（1:200）及Texas Red标记的Avidin（1:200）及Fluorescein标记的驴抗豚鼠IgG（1:500）代替原二抗。余反应步骤同。3.包埋前染色免疫电镜法将电镜组第一套切片用小鼠抗ENK（1:500）及豚鼠抗MOR（1:500）代替原一抗,用Biotin标记的绵羊抗小鼠IgG（1:200）及纳米金标记的山羊抗豚鼠IgG代替原二抗。将电镜组第二套切片用豚鼠抗MOR（1:500）及兔抗GABA（1:5000）代替原一抗,用Biotin标记的绵羊抗兔IgG（1:200）及纳米金标记的山羊抗豚鼠IgG代替原二抗。余反应步骤同。结果1.在激光共聚焦扫描显微镜下1.1 GABA/MOR双标反应可见:可见rNTS内分布着GABA-ir、MOR-ir结构。GABA-ir（红色）和MOR-ir（绿色）结构均以散在分布且直径为10-15μm的小型神经元为主。可见同时呈GABA和MOR免疫反应阳性的神经元。1.2 ENK/MOR双标反应可见:可见rNTS内分布着ENK-ir（红色）终末与MOR-ir神经元（绿色）。ENK-ir终末与MOR-ir神经元的胞体及突起形成密切接触。2.在电镜下2.1 GABA/MOR双标反应可见:GABA与MOR共存于胞体及树突内,GABA阳性（GABA-ir）产物主要分布于粗面内质网及核糖体表面等结构,MOR阳性（MOR-ir）产物位于树突膜、线粒体膜、内质网膜等结构表面。GABA-ir与MOR-ir共存神经元与免疫反应阴性的终末形成对称性及非对称性突触,以对称性突触为主。2.2 ENK/MOR双标反应可见:可见到大量的ENK-ir轴突和终末和MOR-ir胞体和树突。在ENK-ir终末内,可见DAB反应产物主要沉积于圆形清亮囊泡表面及线粒体等细胞器表面,在部分终末内还可见到阳性的大颗粒囊泡。ENK-ir终末与MOR-ir神经元的胞体及树突形成以对称性为主的突触联系。部分MOR-ir产物存在于轴突末端,且与ENK-ir产物共存,并且与免疫反应阴性树突形成对称性突触。结论rNST内的GABA能神经元表达MOR,而ENK-ir终末可能通过与MOR结合调节GABA能神经元的活性,从而参与味觉信息的感受和调节。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 孤束核味觉区脑啡肽和γ-氨基丁酸对味觉信息的调制作用
• 引言
• 第一部分 孤束核内微量注射脑啡肽和γ-氨基丁酸引起大鼠摄食改变的行为学研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附表
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 大鼠延髓孤束核吻侧段内脑啡肽阳性终末与γ-氨基丁酸阳性神经元联系的形态学研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附表
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 大鼠延髓孤束核吻侧段内GABA 和MOR 共存神经元及ENK 阳性终末与MOR 阳性神经元联系的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附表
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 致谢
• 个人简历