新型雌激素受体信号途径调节因子的分离及鉴定

论文摘要

雌激素受体（ER）是核受体超级家族成员之一,它包括两种亚型:α和β。两种亚型在结构上基本相似: 一级结构上,从N 端到C 末端,它们均由Α、Β、C、D、E 和F 共6 个部分组成,含两个转录激活区AF1 和AF2。AF1 具有雌激素不依赖的转录激活功能,位于A/B 区;AF2 具有雌激素依赖的转录激活功能,位于E/F 区。AF1 和AF2 的有效转录激活均依赖于与其它蛋白质的相互作用。越来越多的证据表明,ER 除主要在细胞核中发挥作用外,它们也有一部分存在于细胞膜上。与胞内受体相比,膜受体只占2-3%。雌激素可以通过膜上的蛋白质即膜ER 快速激活细胞内的第二信号系统,间接调节一系列基因转录,在多种细胞类型中快速发挥生物学效应。膜ER 可能直接或间接地与G 蛋白偶联受体作用激活多种信号通路,产生cAMP, 激活PLC 和IP3,促进级联反应,增强ERK、JNK和P38 MAPK 活性。另外,膜ER 与核ER 功能互补,使细胞在雌激素作用下既可以快速改变蛋白质活性,又可以持久调节蛋白的合成及功能。目前认为ER 是乳腺癌内分泌治疗的靶标和预后指标之一。乳腺癌内分泌的治疗主要是通过降低ER 转录活性而实现。因此调节ER 转录活性的蛋白因子的发现和相应的功能研究对于有效开发治疗与雌激素相关疾病的药物具有重大意义。有研究表明,CTGF 在乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤中过度表达。CTGF 是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽,其分子量为36～38kD,属于即早基因CCN 家族。作为分泌蛋白,CCN 蛋白可以充当桥梁将胞外基质蛋白与细胞表面分子在结构与功能上联系起来,并通过与其它信号分子的串话,促进有丝分裂、细胞粘附、细胞凋亡、细胞迁移,并调控血管发生、肿瘤生长等生物学过程。作为细胞生长关键性调节因子,CTGF 参与乳腺癌的发生和发展过程。本实验以ERβAF1 为诱饵蛋白,通过酵母双杂交方法筛选出CTGF。首次发现分泌蛋白CTGF 与ER存在直接相互作用,并且体外GST pull-down实验进一步证实CTGF 与ERα、ERβ全长都存在相互作用。通过与CTGF 高度同源的NOV 蛋白比较,发现CTGF 与ER 的结合具有高度特异性。由这些结果我们推测,CTGF 可能是ER 信号途径的新型调节因子。另外,分泌蛋白CTGF 也可能通过特异性受体-膜ER 参与MAPK信号通路,在乳腺癌的发展过程中发挥重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACR
• 英文缩写词
• 1前言
• 2材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 引物合成
• 2.1.2 菌株、细胞株、质粒和文库
• 2.1.3 酵母双杂交实验常用试剂
• 2.1.4 菌株培养
• 2.1.5 细胞培养试剂
• 2.1.6 细胞和细胞培养
• 2.1.7 常用分子生物学试剂
• 2.1.8 常用分子生物学试剂盒
• 2.1.9 抗体
• 2.1.10 常规无机盐试剂
• 2.1.11 大型仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 载体的构建
• 2.2.2 酵母双杂交（Yeasttwo-hybrid）
• 2.2.3 哺乳动物细胞转染
• 2.2.4 Westernblot分析
• 2.2.5 浓缩细胞上清液
• 2.2.6 GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.2.7 His融合蛋白的纯化
• 2.2.8 GSTpull-downassay
• 3结果
• 3.1 酵母双杂交筛选与ERΒ相互作用的蛋白质
• 3.1.1 用于酵母双杂交的pGBK-T7-AF1表达载体的构建及表达
• 3.1.2 用于酵母双杂交的3-AT（3-amin-otriazole）浓度的确定
• 3.1.3 乳腺文库的筛选
• 3.2 表达载体的构建
• 3.2.1 GST-ERβ-AF1表达载体的构建
• 3.2.2 His-CTGF和His-NOV表达载体的构建
• 3.2.3 pcDNA3-FLAG-CTGF表达载体的构建
• 3.3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 3.3.1 GST-ERβ-AF1融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 3.3.2 His-CTGF和His-NOV融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 3.3.3 pcDNA3-FLAG-CTGF在哺乳动物细胞中的表达
• 3.4 CTGF与ER的体外结合
• 3.4.1 His-CTGF和His-NOV融合蛋白与ER在体外的相互作用
• 3.4.2 pcDNA3-FLAG-CTGF与ERβ在体外的相互作用
• 4讨论
• 5结论和研究展望
• 5.1 结论
• 5.2 研究展望
• 6附录
• 6.1 克隆
• 6.2 引物
• 6.3 常用溶液
• 7参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表文章