水稻端粒及着丝粒相关序列的转化及其功能研究

论文摘要

具有自主复制功能的真核生物染色体必须具备三大基本组成要素,即着丝粒（Centromere）、复制原点（Origin of replication）和端粒（Tolomere）,这三个组成要素已在一些模式生物的人工染色体构建中得到验证。着丝粒既是姊妹染色单体的结合点,又是纺锤丝的附着点,因而在染色体配对及维系生物体遗传信息稳定传递中起重要作用。而端粒的序列最为简单,不同生物类型间的保守性也最强,不同物种之间均为TT（T）AGGG不同数量的简单串联重复序列。在功能上,端粒对于维持染色体的完整性显得尤为重要,对于缺少端粒的染色体,它将不断发生断裂,因而在细胞分裂过程中不能稳定传递。水稻是重要的粮食作物,同时也是单子叶植物基因组及分子生物学研究的重要模式生物。用水稻来研究端粒及着丝粒的结构与功能具有以下几方面的优点:1)水稻全基因组已经测序,从而可以为端粒及着丝粒研究提供丰富的基因组信息;2)水稻染色体很小,含有的重复序列也较少,更利于与分子生物学技术相结合,采用具有很高分辨率的粗线期染色体进行荧光原位杂交,这是具大染色体生物所无法进行的;3)水稻的遗传转化比较容易,因此利用转基因技术将一段端粒及着丝粒相关序列插入到水稻受体细胞中,一方面可研究该插入序列的功能,同时还可以获得相应的细胞学变异材料,为深入研究它们的功能提供丰富的基础材料。本研究构建了水稻端粒和着丝粒相关DNA序列的表达载体,应用农杆菌介导法将其转化到水稻品种中,获得了一批转化水稻植株,主要研究结果如下:1、籼稻的遗传转化比粳稻难度大,为探索一套适合籼稻农杆菌转化的技术体系,以籼稻品种中籼3037为材料,研究了影响农杆菌介导转化效率的几个重要因素,结果表明:MSⅡ培养基作为愈伤组织的诱导培养基要好于N6D2培养基;以幼胚为外植体,愈伤组织的诱导率和转化率明显比成熟胚和幼穗高;根癌农杆菌菌株EHA105介导的基因转化率要高于AGLO;当以幼胚为外植体时,根癌农杆菌菌株EHA105介导的中籼3037转化率为18。0%,而AGLO仅为5.5%;EHA105菌液OD值为0.6,浸染时间14min为中籼3037合适的转化参数;在分化培养基MSR中添加20g/L的山梨醇有利于抗性愈伤组织的分化。在此基础上,采用优化的农杆菌介导法转化中籼3037及其来源的突变体A和B,获得了转化植株,PCR、Southern杂交和T1代遗传分析均表明外源基因已经整合到水稻基因组中。2、采用优化的农杆菌介导方法,将CFP-OsCENH3嵌合基因导入水稻品种中籼3037中,经PCR及Southern杂交检测,证明该嵌合基因确已整合到水稻的基因组中。对T0及T1代转基因水稻植株有丝分裂和减数分裂过程中GFP蛋白与水稻CENH3蛋白表达关系的研究表明,CENH3的表达部位与GFP蛋白的表达部位完全重叠,说明GFP蛋白与水稻CENH3蛋白已构成融合蛋白,并且定位于染色体的着丝粒部位。为探索该转基因植株在水稻遗传及分子生物学研究中的作用,利用花粉母细胞减数分裂偶线期染色体,借助水稻着丝粒串联重复序列CentO的FISH,发现GFP信号与CentO信号完全重叠,证明CentO序列确实为水稻不同染色体功能性着丝粒的主要成分。利用该转基因植株,分别制作根尖细胞有丝分裂染色体和花粉母细胞减数分裂染色体制片,与anti-α-tublin微管蛋白抗体和anti-PAIR2抗体进行荧光免疫染色反应,表明该转基因植株携带GFP标记的着丝粒,可以与其它分子生物学手段相结合,并能在活体细胞及组织中十分方便地显示每一染色体功能性着丝粒位置,为深入研究着丝粒功能提供了宝贵的遗传材料。3、根据水稻端粒酶基因的生物信息学分析,利用RNA干涉技术使水稻中端粒酶亚基失活,并借此来影响水稻染色体的端粒长度。用农杆菌介导法将表达载体pCam23A-1-2导入水稻品种日本晴中,获得了78个转化子,得到了165棵转化植株。通过PCR检测和Southern杂交分析,初步证明获得了端粒酶亚基失活的转基因水稻;应用染色体末端限制片段分析法结合FISH检测分析,显示在端粒酶亚基失活的水稻中端粒DNA序列长度有逐代缩短的趋势,但是在转基因水稻的T0和T1代植株中其主要农艺性状没有发生明显变化。4、应用农杆菌介导法将602bp的端粒DNA序列导入粳稻品种武香粳9号中,获得了652个转化子,得到了1782棵单株,根据表型观察、T-DNA的PCR检测和Sourhern杂交结果,初步证明端粒DNA序列已经整合到转基因水稻中,在转基因植株的后代中获得了一系列突变体,其中涉及染色体变异的包括同源四倍体、非整倍体,染色体相互易位突变体等。而涉及单个基因变异的包括早熟、迟熟、矮秆、低育等突变体。5、利用农秆菌介导法转化粳稻品种武香粳9号,产生T-DNA插入群体。在筛选和鉴定水稻T-DNA插入突变体的过程中,发现一个矮秆突变体。利用PCR扩增、Southern杂交等分子生物学方法对该突变体后代进行了鉴定及遗传分析。遗传分析表明,突变体自交后代群体中出现矮秆和正常株高两种类型,分离比为3:1,符合一对显性单基因控制的遗传模式,并且矮秆性状的表现与T-DNA插入共分离。利用籼稻品种龙特甫与其纯合矮秆植株进行杂交,杂交F2代的矮秆株与正常株的比例同样呈3:1分离,符合一对显性单基因的遗传规律。利用SSR等分子标记,将该基因定位在水稻的第4染色体上,为进一步分离该基因创造了很好的遗传材料。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第1章 文献综述
• 1.0 前言
• 1.1 真核生物染色体末端——端粒
• 1.1.1 端粒的概念
• 1.1.2 端粒DNA序列
• 1.1.3 端粒重复序列长度的变化
• 1.1.4 端粒的结构特点
• 1.1.5 端粒酶与端粒的合成
• 1.1.6 端粒结合蛋白
• 1.1.6.1 端粒DNA双链结合蛋白
• 1.1.6.2 端粒DNA单链结合蛋白
• 1.1.6.3 端粒相关蛋白
• 1.1.7 端粒的细胞学
• 1.1.8 端粒的功能
• 1.2 生物染色体关键元件——着丝粒
• 1.2.1 着丝粒的概念
• 1.2.2 着丝粒的功能
• 1.2.3 着丝粒DNA序列
• 1.2.4 着丝粒/动粒蛋白复合体
• 1.2.5 异染色质化的着丝粒含有功能基因
• 1.2.6 着丝粒的进化
• 1.3 人工染色体的研究进展
• 1.3.1 人工染色体的概念
• 1.3.2 人工染色体的种类及特点
• 1.3.2.1 YAC（酵母人工染色体）
• 1.3.2.2 BAC（细菌人工染色体）
• 1.3.2.3 PAC（P1衍生人工染色体）
• 1.3.2.4 MAC（哺乳动物人工染色体）
• 1.3.2.5 BIBAC（双元细菌人工染色体）
• 1.3.2.6 TAC（可转化人工染色体）
• 1.3.2.7 HAC（人类人工染色体）
• 1.3.2.8 PLAC（植物人工染色体）
• 1.3.3 人工染色体的合成策略
• 1.3.3.1 组装法
• 1.3.3.2 截短法
• 1.3.4 人工染色体的用途
• 1.3.4.1 构建基因组物理图谱
• 1.3.4.2 基因的图位克隆
• 1.3.4.3 转基因技术
• 1.3.4.4 比较基因组学
• 1.3.4.5 基因治疗
• 1.4 本研究的目的及其研究内容
• 参考文献
• 第2章 农杆菌介导籼稻中籼3037转化体系的优化及其应用
• 2.0 前言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 水稻品种
• 2.1.2 质粒、农杆菌菌株
• 2.1.3 化学试剂及药品
• 2.1.4 水稻的愈伤组织培养
• 2.1.5 农杆菌菌液浓度和浸染时间的确立实验
• 2.1.6 转基因植株的分子鉴定
• 2.1.7 转基因植株潮霉素抗性鉴定
• 2.1.8 转基因植株的种植
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 影响中籼3037转化因素的研究
• 2.2.1.1 愈伤组织诱导培养基的筛选
• 2.2.1.2 不同农杆菌菌株浸染效率的比较
• 2.2.1.3 中籼3037不同外植体转化效率的比较
• 2.2.1.4 农杆菌菌液浓度和浸染时间对中籼3037转化率的影响
• 2.2.1.5 山梨醇对愈伤组织分化的影响
• 2.2.1.6 农杆菌介导转化中籼3037体系的确立
• 2.2.2 农杆菌介导转化中籼3037体系的应用
• 2.2.2.1 不同品种（系）间转化效率的比较
• 2.2.2.2 转基因植株的PCR检测
• 2.2.2.3 转基因植株Southern blotting分析
• 2.2.2.4 转基因植株后代遗传分析
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 参考文献
• 第3章 GFP-OsCENH3融合转基因水稻的创建及其遗传应用
• 3.0 前言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 农杆菌菌株及质粒
• 3.1.3 探针、分子生物学试剂
• 3.1.4 农杆菌介导的水稻转化
• 3.1.5 转基因水稻植株总DNA的PCR和Southern杂交分析
• 3.1.6 荧光原位杂交及蛋白质抗体免疫荧光染色反应
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 转基因水稻植株的获得
• 3.2.2 转基因水稻植株的PCR检测
• 3.2.3 转基因水稻植株Southern杂交分析
• 3.2.4 GFP与CENH3蛋白在转基因水稻中的细胞学定位
• 3.2.5 GFP-CENH3融合蛋白与水稻着丝粒特异重复序列CentO的细胞学定位
• 3.2.6 GFP-CENH3融合蛋白与微管蛋白和PAIR2蛋白的细胞学定位
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 参考文献
• 第4章 水稻端粒酶催化亚基基因RNA干涉的初步研究
• 4.0 前言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 水稻材料
• 4.1.1.2 菌株和载体
• 4.1.1.3 分子生物学试剂和化学试剂
• 4.1.1.4 培养基
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 TERT蛋白的生物信息学
• 4.1.2.2 水稻的转化程序
• 4.1.2.3 PCR检测分析
• 4.1.2.4 Southern杂交分析
• 4.1.2.5 染色体末端限制片段分析法
• 4.1.2.6 染色体荧光原位杂交
• 4.1.2.7 转基因植株的种植
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 TERT基因的生物信息学分析
• 4.2.1.1 TERT蛋白序列的多重比较分析
• 4.2.1.2 TERT蛋白序列的进化树分析
• 4.2.1.3 水稻OsTERT基因的外显子与结构
• 4.2.2 表达载体的获得
• 4.2.3 转基因水稻植株的获得
• 4.2.4 转基因水稻植株的分子生物学鉴定
• 4.2.4.1 转基因水稻植株的PCR分析
• 4.2.4.2 转基因水稻植株总DNA的Southern杂交分析
• 4.2.4.3 转基因植株染色体端粒DNA长度变化分析
• 4.2.5 转基因植株细胞学鉴定
• 4.2.6 转基因植株的农艺性状
• 4.3.讨论
• 4.3.1 端粒酶亚基缺失的水稻出现农艺性状变异世代的估算
• 4.3.2 端粒酶活性的测定
• 4.4 结论
• 参考文献
• 第5章 农杆菌介导端粒DNA转化及突变体分析
• 5.0 前言
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.1.1 水稻品种
• 5.1.1.2 菌株和载体
• 5.1.1.3 分子生物学试剂和化学试剂
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 质粒提取纯化
• 5.1.2.2 农杆菌感受态的制备
• 5.1.2.3 农杆菌的转化
• 5.1.2.4 水稻遗传转化过程
• 5.1.2.5 转基因水稻植株总DNA的PCR分析
• 5.1.2.5.1 基因组DNA的小量提取:CTAB法
• 5.1.2.5.2 转基因水稻植株总DNA的PCR扩增
• 5.1.2.6 转基因水稻植株总DNA的Southern杂交分析
• 5.1.2.6.1 大量总DNA的提取:SDS法
• 5.1.2.6.2 Southern杂交分析
• 5.1.2.6.2.1 酶切
• 5.1.2.6.2.2 转膜
• 5.1.2.6.2.3 DNA在尼龙膜上的固定
• 5.1.2.6.2.4 DIG标记的特异性探针的制备
• 5.1.2.6.2.5 预杂交
• 5.1.2.6.2.6 杂交
• 5.1.2.6.2.7 洗膜
• 5.1.2.6.2.8 显影
• 5.1.2.7 细胞学检测
• 5.1.2.8 转基因水稻植株田间种植与性状观察
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 转化载体的构建
• 5.2.2 转基因水稻植株的获得
• 5.2.3 转基因水稻植株的分子生物学鉴定
• 5.2.3.1 转基因水稻植株的PCR分析
• 5.2.3.2 转基因水稻植株总DNA的Southern杂交分析
• 5.2.4 转基因水稻植株农艺性状
• 0代的植株性状分析'>5.2.4.1 T₀代的植株性状分析
• 1代植株的遗传分析'>5.2.4.2 T₁代植株的遗传分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 有关转化载体的问题
• 5.3.2 载体中端粒DNA序列长度的问题
• 5.3.3 转基因水稻中变异植株的来源
• 5.4 结论
• 参考文献
• 第6章 一个显性矮秆水稻突变体的获得及其遗传分析
• 6.0 前言
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 植物材料
• 6.1.2 农秆菌菌株及质粒
• 6.1.3 生化试剂
• 6.1.4 根癌农秆菌介导的水稻转化
• 6.1.5 转基因水稻的分子鉴定
• 6.1.6 潮霉素抗性鉴定
• 6.1.7 突变体的种植
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 矮秆突变体的获得
• 6.2.2 矮秆突变体的性状表现
• 6.2.3 突变体的分子鉴定
• 6.2.4 矮秆突变性状的遗传分析
• 6.2.4.1 矮秆突变性状与T-DNA共分离的遗传分析
• 6.2.4.2 杂合矮秆突变体自交后代遗传分析
• 6.2.4.3 纯合矮秆突变体测交后代遗传分析
• 6.3 讨论
• 6.4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录