犁头尖凝集素（Typhonium divaricatum（L.） Decne agglutinin）的纯化、性质研究、分子克隆及表达

论文摘要

天南星科植物犁头尖是我国传统中药，其根状茎中含有一种凝集素，命为犁头尖凝集素(Typhonium divaricatum(L.)Decne agglutinin，TDA)。利用层析等方法分离得到TDA蛋白纯品。性质研究发现TDA具强的兔血细胞凝集素活性，在浓度为0.95 μg／ml时仍能凝集兔红细胞；分子量为48 KD；等电聚焦结果显示，TDA的等电点大约为4.5和6.5，表明TDA是由两个不同亚基组成的四聚体。糖抑制实验结果显示甘露聚糖肽，卵粘蛋白，去唾液酸糖蛋白和猪甲状腺球蛋白对TDA的凝血活性有很强的抑制作用，表明TDA是甘露糖特异性结合蛋白质。 研究不同温度和pH对TDA的兔红细胞凝集活性的影响，结果表明TDA是一种对热，对酸碱相对稳定的蛋白质。TDA对金属离子也不依赖。 采用荧光淬灭方法研究TDA蛋白质溶液的构象，表明不带电荷的极性淬灭剂丙烯酰胺能淬灭100％的色氨酸的荧光，阴离子淬灭剂KI和阳离子淬灭剂CsCl则分别淬灭了83.3％和50％的荧光，说明TDA分子中的色氨酸大部分都位于分子表面，小部分埋藏于分子内部疏水环境中，这与荧光光谱的结果是一致的。 用荧光光谱法研究了脲、盐酸胍和SDS三种变性剂在不同浓度下构象的变化和凝血活性的变化情况。研究发现三种变性剂均导致TDA结构的改变破坏活性中心，使得凝血活性下降，甚至丧失。 采用基团特异性化学修饰剂对TDA的特定氨基酸残基进行修饰，结合其凝血活性的变化，并通过荧光光谱学手段研究TDA分子构象的变化。研究发现色

论文目录

• 图片目录
• 表格目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 犁头尖凝集素（Typhonium divaricatum（L.）Decne agglutinin）的分离纯化和基本性质研究
• 摘要
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2.方法
• 1.2.1 犁头尖凝集素的分离纯化
• 1.2.2 蛋白纯度检测
• 1.2.3 Sephacryl S-200分子筛层析测定表观分子量
• 1.2.4 等电聚焦
• 1.2.5 蛋白浓度测定
• 1.2.6 犁头尖凝集素凝血活性测定
• 1.2.7 犁头尖凝集素糖抑制实验
• 1.2.8 温度,pH,金属离子对蛋白活性的影响
• 1.2.9 内源荧光光谱测定
• 1.2.10 荧光淬灭
• 1.2.11 变性剂对TDA凝血活性的影响
• 1.2.12 色氨酸修饰及被修饰色氨酸残基数的测定
• 1.2.13 其他氨基酸修饰
• 1.2.14 TDA的抗虫活性
• 1.2.15 TDA对肿瘤细胞的作用（采用SRB法）
• 1.2.16 TDA对单纯疱疹病毒（HSV—Ⅱ）的抑制作用（采用MTT法）
• 2.结果
• 2.1 犁头尖凝集素的分离纯化
• 2.2 TDA纯度和分子量测定
• 2.3 等电聚焦
• 2.4 TDA的凝血活性检测和糖抑制实验结果
• 2.5 不同温度,pH和金属离子对TDA凝集活性的影响
• 2.6 内源荧光光谱测定
• 2.7 荧光淬灭
• 2.8 变性剂对TDA活性和荧光光谱的影响
• 2.9 氨基酸修饰
• 2.10 色氨酸修饰
• 2.11 抗虫活性
• 2.12 抗肿瘤活性
• 2.13 抗HSV-Ⅱ病毒活性
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二章 犁头尖凝集素（Typhonium divaricatum（L.）Decne agglutinin）的基因克隆及序列分析
• 摘要
• 前言
• 1.材料和方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 犁头尖总RNA的提取
• 1.2.2 总DNA的提取
• 1.2.3 总RNA和DNA的定量分析
• 1.2.4 RT-PCR反应
• 1.2.5 PCR扩增片段的回收、连接
• 1.2.6 PCR扩增片段的转化、鉴定和测序
• 1.2.7 犁头尖凝集素基因组序列的获得
• 1.2.8 犁头尖凝集素基因序列的生物信息学分析
• 2 结果和分析
• 2.1 犁头尖总RNA及DNA的质量分析
• 2.2 犁头尖凝集素cDNA基因全长的扩增与克隆
• 2.3 犁头尖凝集素基因全长核苷酸序列及其分析
• 2.4 犁头尖凝集素推测出的氨基酸序列及其分析
• 2.4.1 TDA推导出的氨基酸序列
• 2.4.2 犁头尖凝集素（TDA）（PCLII）推测的氨基酸序列的同源性分析
• 2.4.3 犁头尖凝集素（TDA）信号肽的分析
• 2.4.4 TDA成熟蛋白序列的分析
• 2.4.5 TDA前体蛋白的跨膜区预测
• 2.4.6 蛋白的修饰位点预测
• 2.4.7 蛋白的二级结构预测
• 2.4.8 TDA蛋白的三维结构预测
• 2.4.9 TDA成熟蛋白序列中结构域的预测与分析
• 2.4.10 TDA和其他单子叶甘露糖结合凝集素的进化关系
• 2.4.11 TDA基因与大肠杆菌密码子使用频率的比较
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三章 犁头尖凝集素（Typhonium divaricatum（L.）Decne agglutinin）基因在大肠杆菌中的表达
• 摘要
• 前言
• 1.材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 犁头尖凝集素（TFA）基因片段的制备
• 1.2.2 表达载体的制备
• 1.2.3 大肠杆菌Top10、M15感受态细胞的制备
• 1.2.4 表达片断的酶切、连接及克隆
• 1.2.5 表达产物菌落Western检测
• 1.2.6 转化子的鉴定
• 1.2.7 犁头尖凝集素（TDA）的诱导表达和SDS-PAGE分析
• 1.2.8 表达条件的优化
• 1.2.9 表达产物可溶性检测
• 1.2.10 表达产物的纯化
• 1.2.11 表达产物的活性检测
• 2 结果与分析
• 2.1 犁头尖凝集素（TDA）基因片段的克隆与表达载体的构建
• 2.2 重组表达质粒的筛选和检测
• 2.3 犁头尖凝集素（TDA）表达产物的SDS-PAGE检测
• 2.4 犁头尖凝集素（TDA）表达条件的优化
• 2.5 表达产物可溶性检测
• 2.6 犁头尖凝集素（TDA）基因表达产物的纯化
• 2.7 犁头尖凝集素（TDA）纯化蛋白的活性检测
• 小结
• 第四章 犁头尖凝集素（Typhonium divaricatum（L.） Decne agglutinin）基因转化烟草及其在转基因烟草中的表达
• 摘要
• 前言
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 犁头尖总RNA的提取
• 1.2.2 犁头尖凝集素基因（TDA）的制备
• 1.2.3 pBI121载体的构建
• 1.2.4 载体对农杆菌的转化及鉴定
• 1.2.5 农杆菌介导的烟草的转化
• 1.2.6 转基因烟草苗的获得及形态观察
• 1.2.7 转基因植株的检测
• 1.2.8 凝血活性的测定
• 1.2.9 抗虫活性的检测
• 1.2.10 转基因子代的组织培养和检测
• 2 结果与分析
• 2.1 犁头尖凝集素（TDA）基因的扩增
• 2.2 表达载体的构建
• 2.2.1 表达载体pBI121的制备
• 2.2.2 目的片段的制备
• 2.2.3 表达载体的连接与转化
• 2.2.4 表达载体的鉴定
• 2.2.5 农杆菌中重组质粒的鉴定
• 2.3 Kan抗性植株的分化与形态观察
• 2.4 转基因植株的鉴定
• 2.4.1 PCR检测
• 2.4.2 Southern杂交检测
• 2.4.3 反转录聚合链式扩增检测
• 2.5 凝血活性检测
• 2.6 抗虫活性的检测
• 2.7 转基因子代的组培和检测
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 文献综述：凝集素的研究进展
• 前言
• 1 凝集素的分类
• 1.1 植物凝集素
• 1.2 动物凝集素
• 1.3 微生物凝集素
• 2 凝集素的结构
• 3 凝集素的性质
• 3.1 凝集素的基本特性
• 3.2 植物凝集素的生物学特性
• 3.3 动物凝集素的生物学特性
• 4 凝集素的功能
• 4.1 防御功能
• 4.2 鉴定功能
• 4.3 对肿瘤的诊断
• 4.4 对肝、胆、胰疾病的诊断
• 5 凝集素的应用
• 5.1 在肿瘤治疗中的应用
• 5.2 在肿瘤预后的应用
• 5.3 凝集素在抗病毒、抗菌药物设计上的应用
• 6 重组植物凝集素研究其结构与功能
• 6.1 克隆与表达
• 6.2 突变
• 6.3 应用结构功能研究
• 7 展望
• 参考文献
• 在读期间发表和待发表论文及获奖情况
• 致谢