利用农杆菌介导法鉴定NTHK1基因功能及其遗传转化

论文摘要

NTHK1是从烟草中克隆出来的乙烯受体基因,能被机械损伤、NaCl和PEG诱导,这说明NTHK1可能参与了盐和干旱的信号传递过程。所以,NTHK1可能与多种逆境胁迫有关。由于NTHK1基因的功能在大豆中还没有确认。为便于在大豆转基因育种中应用,首先要在大豆中验证其功能。实验结果表明:1.构建了发根农杆菌和根癌农杆菌两个表达载体,并利用BamHI和NotI酶切验证了构建的正确性。2.采用低浓度（0.101和0.213）的菌液进行侵染发根较为合适,既可保证产生毛状根的数量,又可以保证有较高的转化率。3.通过PCR,RT-PCR检测分析及GUS基因的染色、切片,表明基因整合到植物组织中并有较高的活性。4.界定了潮霉素筛选毛状根的临界浓度为10mg/L。5.将利用潮霉素筛选过毛状根置于不同NaCl浓度处理,发现随NaCl浓度的增加,转化根及非转化根的生根数量逐渐减少,并且相同浓度下的转化根比非转化根的长势好。通过不同浓度下转基因毛状根和对照的水分测定,表明在盐分胁迫下,相同NaCl浓度下转基因毛状根的吸水量比对照多,可以起到稀释植物体内盐分的作用,以此来降低盐分胁迫对植株的危害。因此,NTHK1基因有耐盐功能。在室外对大豆植株进行耐盐性鉴定,表明具有转基因毛状根的大豆植株在低浓度时比相同浓度的对照植株更具耐盐性;但在高浓度时,二者无明显区别。通过对根系活力、脯氨酸含量、丙二醛含量的测定,表明根系活力随NaCl浓度的增加而逐渐降低,而脯氨酸含量和丙二醛含量随NaCl浓度的增加而逐渐升高。通过对过氧化物同工酶活性的检测,表明随NaCl浓度的增加过氧化物同工酶活性增加。6.用PEG筛选的毛状根无表型变化。但是通过不同浓度下转基因毛状根和对照的水分测定,表明各浓度下转基因毛状根的含水量均明显高于或略高于对照,这说明在干旱胁迫下,相同PEG浓度下转基因毛状根的吸水量比对照多,通过吸收较多的水分来降低干旱胁迫对植株的危害,起到抗旱功能。综上所述,NTHK1基因在大豆中具有一定的耐盐（抗盐）性和耐旱（抗旱）性。另外,本研究还以子叶节为外植体、利用农杆菌介导法对大豆进行遗传转化,以期获得转基因大豆植株。共获得转化大豆植株15棵。通过草丁膦抗性实验和PCR检测分析,有3棵植株呈现阳性,初步证明了NTHK1基因整合到基因组中并且有效表达,从而为进一步获得抗逆性的转基因大豆品种奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究目的与意义
• 1.2 国内外研究动态
• 1.2.1 乙烯及乙烯受体的研究
• 1.2.2 NTHK1 基因的研究进展
• 1.2.3 农杆菌介导的转化体系
• 1.2.4 基因其他转化方法
• 1.2.5 作物耐旱性研究进展
• 1.2.6 作物耐盐性研究进展
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验仪器
• 2.3 主要试剂和药品
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 大肠杆菌中质粒 DNA 的小量提取
• 2.4.2 植物基因组 DNA 的提取
• 2.4.3 限制性内切酶酶切反应
• 2.4.4 连接反应
• 2.4.5 目的DNA 片段的电泳回收
• 2.4.6 感受态细胞的制备及宿主细胞的转化
• 2.4.7 发根农杆菌介导的大豆根系转化体系
• 2.4.8 目的基因的引物设计和 PCR 扩增
• 2.4.9 RT-PCR 检测
• 2.4.10 GUS 基因检测
• 2.4.11 毛状根的潮霉素临界浓度筛选
• 2.4.12 NTHK1 基因耐盐功能鉴定
• 2.4.13 NTHK1 基因耐旱功能的鉴定
• 2.4.14 生理指标的测定
• 2.4.15 根癌农杆菌介导的大豆子叶节再生体系转化
• 3 结果与分析
• 3.1 利用发根农杆菌介导的大豆转化根系鉴定NTHK1 基因功能
• 3.1.1 载体构建
• 3.1.2 表达载体的酶切鉴定
• 3.1.3 发根农杆菌侵染
• 3.1.4 转基因毛状根的验证及筛选
• 3.1.5 NTHK1 基因耐盐功能鉴定
• 3.1.6 NTHK1 基因耐旱功能鉴定
• 3.2 根癌农杆菌介导的遗传转化体系
• 3.2.1 大豆的转化及再生
• 3.2.2 不同品种再生频率的比较
• 3.2.3 再生植株抗除草剂检测
• 3.2.4 再生植株的PCR 检测
• 4 讨论
• 4.1 发根农杆菌转化体系的可能机理及不足
• 4.2 根癌农杆菌转化体系的优化
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文