拟南芥ICE1基因转化番茄的研究

论文摘要

低温这一环境因素限制了许多种植物的地理分布和生长季节,它经常影响作物的品质和产量,是自然界植物分布的一个重要限制因子。低温寒害是农业生产中的一种严重自然灾害,世界上每年因此造成的损失高达2000亿美元,因此,克隆并鉴定调控抗寒功能基因表达的转录因子成为这一研究领域的热点。冷响应转录激活因子CBF（CRT/DRE binding factor）是控制植物抗寒的关键调节因子,ICE1（inducer of CBF expression 1）是唯一的已经鉴定直接作用于CBF启动子的转录因子,它是控制CBF基因的一个主开关。ICE1是许多冷响应靶基因的一个上游调控因子,低温下正调节CBF基因表达,ICE1在常温下也存在,但是没有活性,当植物在低温环境下,ICE1激活CBF基因表达,CBF基因与许多COR基因启动子区域中的CRT/DRE核心元件结合,促进COR基因的表达,从而提高植物的抗寒性。ICE1的作用并非只局限于此,可能还以某种方式调控其他低温应答基因的表达,但它究竟如何调节这些基因表达,目前尚不清楚。本研究拟通过农杆菌介导法将ICE1基因转入番茄,不仅对番茄丰产、品质改善、种植范围的扩大有重要的意义,还为ICE1基因的深入研究提供一个平台。本研究的主要结果如下:（1）从拟南芥中提取总RNA,经RT-PCR扩增、克隆及序列分析,构建了含ICE1基因的植物表达载体。（2）以番茄子叶、下胚轴为外植体,用6-BA、ZT分别与IAA配成6个激素组合,最终确立一个较为理想的分化培养基配方:MS+1mg/L ZT+1 mg/L IAA+3%蔗糖+0.8%琼脂,PH5.8。（3）探索了影响农杆菌介导的番茄遗传转化的若干因素,建立了一个较为理想的番茄遗传转化体系:子叶在分化培养基上预培养2d;侵染时添加100μmol/L乙酰丁香酮（AS）;侵染时间为20min;共培养时间为3d;潮霉素Hyg对子叶的筛选压为15mg/L;当芽长到1cm以上时,将抗性芽切下,转入1/2MS+0.1mg/L IAA+15 mg/L Hyg+300 mg/L Cef的生根培养基中诱导生根。（4）以载体质粒DNA为阳性对照,未转化植株为阴性对照,对得到的再生植株进行PCR反应。检测结果表明:有5株扩增出明显的目的条带,与质粒扩增出的条带位置相同,初步说明外源ICE1已整合到番茄基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物抗寒的生理生化特性
• 1.1.1 冷害引起细胞生理生化及结构的改变
• 1.1.2 膜的相变
• 1.1.3 活性氧和自由基的破坏作用
• 1.2 植物抗寒基因工程
• 1.2.1 转入保护基因
• 1.2.2 转入调控基因
• 1.3 本研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 ICE1 基因的克隆
• 2.2.2 PCR 产物T 克隆
• 2.2.3 植物表达载体pCAMBIA1302-ICE1 的构建
• 2.2.4 植物表达载体转化农杆菌
• 2.2.5 农杆菌介导法转化番茄
• 3 结果与分析
• 3.1 ICE1 基因的克隆
• 3.1.1 拟南芥叶片总RNA 的提取
• 3.1.2 ICE1 基因的扩增
• 3.2 T 克隆的PCR 及酶切鉴定
• 3.3 植物表达载体pCAMBIA1302-ICE1 的PCR 及酶切鉴定
• 3.4 植物表达载体pCAMBIA1302-ICE1 导入农杆菌
• 3.5 番茄遗传转化体系的建立
• 3.5.1 外植体的选择
• 3.5.2 选择最适的分化培养基激素组合
• 3.5.3 番茄子叶对潮霉素Hyg 耐受力的测定
• 3.5.4 乙酰丁香酮（AS）对番茄分化率的影响
• 3.5.5 外植体的预培养对番茄分化率的影响
• 3.5.6 农杆菌侵染时间对子叶转化及再生的影响
• 3.5.7 共培养时间对芽诱导率的影响
• 3.5.8 获得转基因植株
• 3.6 转基因植株的分子检测
• 3.7 T1 代抗性苗的筛选
• 4 讨论
• 4.1 抗寒基因工程需解决的一些问题
• 4.2 影响外源基因转化的一些因素
• 4.3 后续工作
• 5. 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢