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中国原产华东葡萄抗白粉病基因cDNA文库构建及其EST序列分析

2020-11-22阅读(340)

中国原产华东葡萄抗白粉病基因cDNA文库构建及其EST序列分析

论文摘要

葡萄白粉病[Uncinula necator（Schw．）Burr．]是影响世界葡萄生产的主要病害之一。育种实践证明，培育抗病品种是控制葡萄白粉病的经济有效途径。原产我国葡萄野生种华东葡萄（Vitis pseudoreticulata W.T.Wang）株系“白河-35-1”，在多年研究证明它对我国葡萄白粉病表现出极强的抗病性；对其抗白粉病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明抗病机制，而且对葡萄抗白粉病研究及抗病基因的育种利用具有重要价值。本研究以cDNA文库为基础，以测序为主线，结合生物信息学方法和PCR技术对获得的目标序列进行结构和表达分析，以期获得与抗病有关的EST序列和抗病相关基因。取得如下主要结果： 1．以中国原产华东葡萄株系“白河-35-1”为材料，于2003年7月8日上午8：00-10：00，在西北农林科技大学葡萄种质资源圃进行接种实验；在接种前，选取健康的华东葡萄株系“白河-35-1”的幼叶，用无菌蒸馏水喷湿接种叶片的上叶面，从高度感病的中国原产华东葡萄株系“湖南-1”上取感白粉病的叶片，用病叶压片法人工接种葡萄白粉病病原菌，接种后立即套袋。在接种后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d剪去1.0cm2大小的幼叶叶片，立即放置液氮中，用SDS／酚法提取总RNA；用不同接种时间白粉病病原菌[U.necator（Schw.）Burr.]诱导的叶片分别提取总RNA，然后混合提取的RNA样形成总RNA构建华东葡萄叶片cDNA文库。文库初始滴度为3.0×105pfu／ml，重组率为96.9％，用包装后的原始文库直接转化寄主菌BM 25.8，转化效率为90％以上，插入片段主要分布在0.5-3.O kb之间，平均大小为900bp左右。 2．通过随机测序，获得了107条质量好的cDNA序列；并已登录GenBank数据库，登录号分别为：AY848693、DQ336280、DQ 336281、DQ 336282、DQ 336283、DQ 336284、DQ336285、DQ336286、DQ336287、DQ336288、DQ336289、DQ339462、DQ 339463、DQ 339464、DQ354157、DQ354158、DQ354159、DQ354160、DQ354161、DT646287、DT661587、DT 661588、DT661589、DT661590、DT661591、DT661592、DT661594、DT 661595、DT 661596、DT 661597、DT661598、DT661599、DT6615600、DT661601、DT661603、DT661605、DT661608、DT661610、DT 661611、DT661613、DT661614、DT661615、DT661616、DT661618、DT661619、DV182076、DV182077、DV182078、DV182080、DV182981、DV182082、DV182084、DV182085、DV182086、DV182087、DV182088、DV182089、DV182090、DV182091、DV182092、DV182093、DV182094、

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 研究进展及本研究目的
  • 1.1 研究进展
  • 1.1.1 全长cDNA克隆策略
  • 1.1.1.1 cDNA文库大量测序技术
  • 1.l.1.2 cDNA末端快速扩增法（RACE）
  • 1.1.1.3 硅片克隆
  • 1.1.1.4 判断全长cDNA序列的一般标准
  • 1.1.2 植物功能基因组学研究
  • 1.1.2.1 植物表达序列标签
  • 1.1.2.2 植物基因功能研究
  • 1.1.2.2.1 基因表达的系统分析(（sAGE）
  • 1.1.2.2.2 cDNA芯片与寡核苷酸芯片
  • 1.1.2.2.3 蛋白质组研究
  • 1.1.2.2.4 应用反向遗传学研究植物基因功能
  • 1.1.2.2.5 生物信息学及其应用
  • 1.1.3 植物抗病性研究进展
  • 1.1.3.1 植物抗病性的表现
  • 1.1.3.2 植物抗病的分子机制
  • 1.1.3.3 植物抗病性的遗传基础
  • 1.1.3.3.1 植物抗病基因
  • 1.1.3.3.2 植物防卫基因
  • 1.1.4 葡萄抗白粉病简况
  • 1.1.4.1 葡萄白粉病的起源和分布
  • 1.1.4.2 葡萄属植物抗白粉病的分子生物学研究
  • 1.2 研究目的和意义
  • 第二章 田间人工接种葡萄白粉病病原菌诱导中国原产华东葡萄“白河-35-1”株系早期叶片cDNA文库构建
  • 2.1 材料与试剂
  • 2.1.1 材料与处理
  • 2.1.2 cDNA文库构建主要试剂
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 总RNA的提取与检测
  • 2.2.2 总RNA的纯化和检测
  • 2.2.3 DNA文库构建及检测
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 cDNA文库构建样品总RNA浓度和质量检测结果
  • 2.3.2 cDNA的合成
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 构建的cDNA文库的评价
  • 2.4.2 未扩增cDNA文库的滴度与重组率
  • 第三章 田间人工接种葡萄白粉病原菌诱导中国原产华东葡萄“白河-35-1”株系早期叶片cDNA文库EST序列分析
  • 3.1 材料
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 制备cDNA文库测序平板
  • 3.2.2 克隆形式的转换
  • 3.2.3 碱裂解法小量提取质粒
  • 3.2.4 重组质粒Sfi1酶切鉴定及测序
  • 3.2.5 EST序列分析方法
  • 3.2.5.1 测序结果的初步分析
  • 3.2.5.2 Blastn和Blastx分析方法
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 转化效率
  • 3.3.2 序列的产生
  • 3.3.3 Blastn的分析结果
  • 3.3.4 Blastx的分析结果
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 植物基因功能
  • 3.4.2 抗病防卫反应基因作用的研究
  • 3.4.2.1 几丁质酶
  • 3.4.2.2 细胞色素P450
  • 3.4.2.3 多酚氧化酶
  • 3.4.2.4 苯丙氨酸解氨酶和4-香豆酸辅酶A连接酶
  • 3.4.3 金属硫蛋白
  • 3.4.4 抗病信号传导途径
  • 第四章 中国原产华东葡萄抗白粉病泛素结合酶蛋白基因全长cDNA序列分析
  • 4.1 材料和方法
  • 4.1.1 材料
  • 4.1.2 方法
  • 4.1.2.1 泛素结合酶基因的克隆和测序方法
  • 4.1.2.2 利用NCBI网址中的ORF finder、Blastn和Blastx软件对泛素结合酶基因进行序列分析和同源性比较分析
  • 4.1.2.3 利用简单模块构架搜索工具对泛素结合酶基因所编码的蛋白一级序列进行功能结构域分析
  • 4.1.2.4 利用DNASTAR软件对泛素结合酶基因所编码的蛋白质分子量和等电点以及该蛋白序列多重对齐分析和进化关系的分析
  • 4.2 结果与分析
  • 4.2.1 VpUBC克隆及序列分析
  • 4.2.2 Blast nr和Blastx分析结果
  • 4.2.3 不同生物泛素结合酶氨基酸序列同源性分析和同源性分类分析
  • 4.3 讨论
  • 4.3.1 VpUBC蛋白UBCc结构域的功能
  • 4.3.2 植物蛋白泛素化与抗病性的关系
  • 第五章 中国原产华东葡萄抗白粉病环化酶基因全长cDNA序列分析及原核表达
  • 5.1 材料
  • 5.1.1 cDNA文库材料
  • 5.1.2 植物材料
  • 5.2 方法
  • 5.2.1 cDNA片段克隆、测序和分析方法
  • 5.2.1.1 环化酶基因的克隆和测序方法
  • 5.2.1.2 利用NCBI网址中的ORF finder、Blastn和Blastx软件对环化酶基因进行序列分析和同源性比较分析
  • 5 2.1.3 利用简单模块构架搜索工具环化酶基因所编码的蛋白一级序列进行功能结构域分析
  • 5.2.1.4 利用DNASTAR软件对环化酶基因所编码的蛋白质分子量和等电点分析
  • 5.2.2 目的基因的克隆及原核表达
  • 5.2.2.1 目的基因cDNA全长序列的PCR扩增
  • 5.2.2.2 目的基因cDNA片段的回收和克隆
  • 5.2.2.2.1 目的基因cDNA片段的回收方法
  • 5.2.2.2.2 回收片段与克隆载体（pGEM-T-easy）的连接反应方法
  • 5.2.2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备与连接产物的转化方法
  • 5.2.2.2.4 重组质粒的筛选与鉴定方法
  • 5.2.2.2.5 重组质粒的酶切鉴定
  • 5.2.2.3 原核表达载体构建
  • 5.2.2.3.1 目标片段的回收
  • 5.2.2.3.2 目的基因与pGEX-4T-1载体的连接及转化
  • 5.2.2.3.3 重组原核表达载体酶切鉴定
  • 5.2.2.4 葡萄环化酶基因在大肠杆菌中的诱导融合表达
  • 5.3 结果分析
  • 5.3.1 VpCyclase克隆及序列分析
  • 5.3.2 Blastnr和Blastx结果分析
  • 5.3.3 中国原产华东葡萄环化酶基因的PCR扩增
  • 5.3.4 葡萄环化酶基因的克隆和测序
  • 5.3.5 葡萄环化酶基因原核表达载体的构建
  • 5.3.6 葡萄环化酶基因在大肠杆菌中的诱导融和表达
  • 5.4 讨论
  • 5.4.1 葡萄环化酶基因功能的研究
  • 5.4.2 葡萄环化酶基因的原核表达的研究
  • 第六章 中国原产华东葡萄抗白粉病病程相关蛋白基因全长cDNA序列分析
  • 6.1 材料
  • 6.1.1 cDNA文库材料
  • 6.1.2 植物材料
  • 6.2 方法
  • 6.2.1 cDNA片段克隆、测序和分析方法
  • 6.2.1.1 病程相关蛋白基因的克隆和测序方法
  • 6.2.1.2 利用NCBI网址中的ORF finder、Blastn和Blastx软件对病程相关蛋白基因进行序列分析和同源性比较分析
  • 6.2.1.3 利用简单模块构架搜索工具对病程相关蛋白基因所编码的蛋白一级序列进行功能结构域分析
  • 6.2.1.4 利用DNASTAR软件对病程相关蛋白基因所编码的蛋白质分子量和等电点以及该蛋白序列多重对齐分析和进化分类分析
  • 6.2.2 中国原产华东葡萄株系“白河-35-1”、“广西-1”和毛葡萄株系“泰山-12”基因组DNA片段克隆、测序方法
  • 6.2.2.1 葡萄基因组DNA提取方法
  • 6.2.2.2 目的基因DNA全长序列的PCR扩增
  • 6.2.2.2.1 引物的设计与合成
  • 6.2.2.2.2 PCR反应体系
  • 6.2.2.2.3 PCR扩增程序
  • 6.2.2.3 目的基因DNA片段的回收和克隆
  • 6.2.2.3.1 目的基因 DNA片段的回收
  • 6.2.2.3.2 回收片段与克隆载体（pGEM-T-easy）的连接反应
  • 6.2.2.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备与连接产物的转化
  • 6.2.2.3.4 重组质粒的筛选与鉴定
  • 6.2.2.3.5 重组质粒的酶切鉴定
  • 6.3 结果与分析
  • 6.3.1 VpPR10克隆及序列分析
  • 6.3.2 同源性比较分析
  • 6.3.3 葡萄属植物不同种PR10基因的克隆、测序及核酸序列分析
  • 6.3.4 葡萄属植物不同种PR10基因DNA序列外显子同源性分析
  • 6.3.5 葡萄属植物不同种PR10基因推导的氨基酸序列同源性分析
  • 6.4 讨论
  • 6.4.1 植物VpPR10蛋白BetV1结构域
  • 6.4.2 植物PR10蛋白功能
  • 第七章 结论
  • 参考文献
  • 附表3-1
  • 附表3-2
  • 附件1
  • 附件2
  • 英文缩略词
  • 致谢
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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