论文摘要
背景Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是一个结构上高度保守的模式识别受体（Pathogen-associated molecular patterns,PAMP）家族。近年来研究表明TLRs可能通过多个环节调节过敏性疾病的进程,这为研究过敏性疾病机制和寻找更为合理有效的治疗方法提供了契机。近年来,过敏性疾病的发生率在全世界范围内显著增加,这不仅影响患者的生活质量,症状严重者甚至可危及生命。肥大细胞（Mast cell,MC）作为重要的效应和调节细胞,不仅在宿主防御病原菌的天然免疫中发挥关键作用,在过敏性疾病的病程发展中也处于核心地位。新近研究发现,宿主发生防御反应或过敏性疾病时,肥大细胞上的TLRs通过激活TLR信号传导通路,引起肥大细胞活化,在局部细胞因子的产生、多种免疫相关细胞的募集以及受累组织的重组等事件中均扮演重要角色。这表明,肥大细胞在过敏性疾病中,特别是在感染状态下,存在着与传统机制不同的一种新的致病机制,即肥大细胞TLRs的激活效应机制,这为TLRs在过敏性疾病中的作用研究提供了一个新的思路。进一步了解TLRs的作用机制,对肥大细胞的复杂分子机制和TLRs应答的多样性进行深入研究,可为治疗过敏性疾病开辟新的途径,有望在过敏性疾病的治疗方面获得突破性进展。肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）是具有多种生物活性的多肽调节因子,其既参与机体的免疫防御功能,又作为机体的炎症、损伤、甚至休克发病中的重要介质,在过敏性疾病中发挥了重要作用。研究发现,过敏性炎症时肥大细胞释放的TNF-α,通过多种机制促进或者加重过敏性疾病的发生发展。然而,TNF-α是否可以通过调节TLRs的表达而影响肥大细胞活化,继而对过敏性炎症的病程发挥重要调控作用,尚待深入研究。干扰素-λ（Interferon-lambda,IFN-λ）是2003年发现的干扰素超家族,包括IFN-λ1（IL-29）、2（IL-28A）、3（IL-28B）。其中以IL-29和IL-28A的生物学活性最强,目前相关研究主要集中在抗病毒活性,而与炎症相关疾病关系的报道较少。新近研究发现,IL-28A可以改善小鼠与人过敏性哮喘相似的呼吸道症状;本实验室前期研究亦发现哮喘和过敏性鼻炎患者血浆IL-29水平增高,过敏原刺激肥大细胞可引起IL-29大量释放,外源性IL-29对肥大细胞有调节作用,均提示IFN-λ参与过敏性疾病的发生和发展过程。鉴于IL-28A与IL-29的同源性高达80%,IL-29与肥大细胞及过敏性疾病密切相关,提示IL-28A除了其明确的抗病毒作用外,抗炎和抗过敏的作用亦不容忽视,故深入探索IL-28A的生物学活性,其与炎症及过敏性疾病的关系,以及其是否可以通过调节肥大细胞的TLRs应答参与宿主的防御反应,将有助于探讨过敏性疾病的发病机制及为临床治疗提供新的选择。第一部分TNF-α和IL-28A对肥大细胞TLRs表达的调节目的检测IL-28A和TNF-α对鼠肥大细胞（P815）表面TLRs表达的影响。方法不同浓度（0.1、1.0、10、100 ng/ml）TNF-α和IL-28A分别作用于P815,刺激2 h、6 h、16 h后,收集细胞。用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）、定量PCR、流式细胞术和免疫荧光染色方法,在m RNA水平和蛋白水平检测TNF-α和IL-28A对鼠肥大细胞系P815上TLRs的表达调节,以及检测加入不同浓度抗TNF-α（1.0、3.0μg/ml）抗体刺激前后对肥大细胞TLRs表达变化的调节。1、流式细胞仪结果显示,TNF-α可以上调TLR4的表达,且有剂量依赖性。定量PCR和免疫荧光进一步验证了流式细胞术的结果。流式细胞术结果显示不同浓度TNF-α作用2 h、6 h、16 h后检测TLRs的表达,只有TLR4的表达与未刺激的对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）,即TNF-α可以上调TLR4的表达。TNF-α上调TLR4蛋白表达开始于2 h,在16 h呈剂量依赖关系。100ng/ml TNF-α作用肥大细胞16 h可以使TLR4与未刺激的对照组相比上调2.6倍。预先加入抗TNF-α抗体作用后,与未加入抑制抗体相比,能够抑制100 ng/ml的TNF-α所引起的TLR4的上调,并且其差异具有统计学意义（P<0.05）。定量PCR结果进一步验证了流式检测结果。TNF-α在0.1-100 ng/ml可以上调TLR4在m RNA水平的表达,有剂量依赖性。TNF-α作用肥大细胞16 h后,能够上调TLR4 m RNA水平的表达,TNF-α在1 ng/ml可以上调TLR4 m RNA表达7.9倍（与未予以刺激的对照组相比）。100 ng/ml的TNF-α作用2 h、6 h、16 h,结果显示TNF-α对TLR4 m RNA水平的调节开始于刺激后2 h,16 h达到高峰。2、流式细胞仪结果显示,IL-28A对鼠肥大细胞表面TLRs表达水平无显著影响（P>0.05）,不同浓度之间差异无统计学意义（P>0.05）。结果结论TNF-α可以上调鼠肥大细胞TLR4的表达,对其他TLRs（TLR 1、2、3、5、6、7、8、9）的表达无显著影响。应用TNF-α阻断性抗体可以抑制TNF-α所引起的TLR4表达的上调作用,证实TNF-α可以对肥大细胞TLR4的表达产生调节作用,TNF-α可以通过上调TLR4的表达来加重过敏反应。IL-28A对肥大细胞TLRs的表达无显著影响。第二部分IL-28A在过敏性鼻炎病人鼻息肉中的表达目的检测IL-28A在过敏性鼻炎病人鼻息肉中T细胞,B细胞,巨噬细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,成纤维细胞内的表达情况。方法随机收集过敏性鼻炎病人鼻息肉标本15例,经固定包埋成石蜡切片后,采用免疫组化单标染色方法分别检测T细胞,B细胞,巨噬细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,成纤维细胞以及IL-28A在鼻息肉标本中的表达情况,待检测出各细胞及IL-28A在鼻息肉中是否表达后,采用免疫荧光双标检测IL-28A在过敏性鼻炎病人鼻息肉中与T细胞,B细胞,巨噬细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,成纤维细胞的共表达情况,于激光共聚焦显微镜下观察其共表达情况。结果免疫组化单标结果显示T细胞与巨噬细胞在过敏性鼻炎病人鼻息肉中呈阴性表达,B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、成纤维细胞与IL-28A呈阳性表达,其中中性粒细胞和IL-28A呈强阳性表达。免疫荧光双标结果显示IL-28A在B细胞、嗜酸性粒细胞内呈强表达,在中性粒细胞只有个别细胞会出现阳性表达,而在成纤维细胞中呈阴性表达。结论IL-28A在过敏性鼻炎病人鼻息肉中呈强阳性表达,主要表达于B细胞和嗜酸性粒细胞内,弱表达于中性粒细胞,在T细胞与巨噬细胞内不表达,说明IL-28A在过敏性鼻炎鼻息肉中主要来源于B细胞和嗜酸性粒细胞,并可能主要通过这两个细胞发挥其作用。