激活Notch信号的骨髓间充质干细胞心肌移植治疗心梗模型鼠的实验研究

论文摘要

背景由于再生能力有限,心肌梗死后存活的心肌细胞不能修复梗死区,局部心肌组织缺血、缺氧,心肌细胞大量坏死,纤维组织增生,疤痕组织形成,心室重塑,导致心功能下降。BMMSCs移植可以增加梗死区肌细胞数量,改善心功能,血管内皮细胞生长因子在心肌梗死急性期的表达增加,促进梗死区新生血管形成。Notch信号是细胞与细胞之间直接作用的主要信号通路之一,并对多细胞生物中细胞命运的决定起关键作用。ICN是Notch的活性形式,通过载体介导将ICN转染细胞就可以在没有配体存在的情况下激活Notch信号,为研究Notch信号的生物功能提供了方便。目的本研究旨在观察激活Notch信号的BMMSCs移植到梗死心肌后毛细血管密度及心功能改善情况。目前转染ICN基因的BMMSCs移植对心肌梗死后心脏重构的影响还不是很清楚。本研究观察逆转录病毒介导的ICN基因转染BMMSCs后ICN基因的表达,观察逆转录病毒介导的ICN基因转染的诱导BMMSCs植入梗死心肌后对心脏重构的影响,BMMSCs能否在梗死区存活、向心肌细胞方向分化,以及梗死后心功能和心肌灌注是否得到改善,并探讨其机理,为BMMSCs转染基因治疗缺血性心脏病提供实验依据。方法1.用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,体外培养、5-氮胞苷诱导,用相差显微镜、电子显微镜、免疫细胞化学方法和流式细胞仪等对诱导细胞进行鉴定。2.通过逆转录病毒介导的基因转移方法转染ICN激活BMMSCs的Notch信号通路,用RT-PCR法测定转染后ICN在BMMSCs的表达。3.结扎大鼠冠状动脉前降支建立大鼠急性心肌梗死模型,超声心动图观察心肌梗死前、后心功能变化,并观察结扎前、后心电图变化。4.选取的80只近交系Wister大鼠随机分为假手术对照组10只（A组）、建立急性心肌梗死（AMI）模型组70只,成功制成心肌梗死模型并成活60只,建立模型后随机分为MI模型组（B组）、培养液移植组（C组）、激活Noth信号的BMMSCs移植组（D组）、BMSCs移植组（E组）,每组15只。移植前2小时,培养细胞用DAPI标记。结扎冠状动脉后2周,均经前次手术经路开胸,分别向梗死区注射容积为0.1ml的DMEM培养液、BMSCs、激活Noth信号的BMMSCs,假手术组则在左前降支周围心前壁多点注射0.1ml生理盐水。分别在造模后1天、28天行心脏超声心动图检查比较心功能变化。移植后28天处死大鼠,心脏标本测量比较形态变化;心脏标本切片行荧光显微镜检查定位移植细胞存活情况;免疫组化检查Ⅷ因子抗体表达计数毛细血管密度,VEGF表达情况,检查结蛋白,肌钙蛋白I等抗体表达鉴定移植细胞分化,并比较胶原蛋白、基质金属蛋白酶表达变化。结果1.成功分离出大鼠BMMSCs,流式细胞仪检查提示培养细胞表达CD29,Flk-1,CD117等抗体。2.成功地通过逆转录病毒介导的基因转移方法将ICN转染BMMSCs以激活了BMMSCs的Notch信号通路,用RT-PCR法测定转染后ICN在BMMSCs的表达。3.成功制备大鼠急性心肌梗死模型。阻断冠状动脉血流后,心电图示肢体导联ST段压低,心率加快,出现室性早搏;术后ST段弓背抬高,术后8小时ST段下降,QRS波增宽,出现病理性Q波;术后24小时彩色多普勒超声检查见左心室心腔扩大,前壁局部心肌运动障碍,左心室射血分数术后（39.67±2.33）%较术前（62.35±3.49）%及假手术组（60.52±4.75）%明显下降（p＜0.01）;术后4周的大鼠心脏标本HE染色可见左心室前壁局部结缔组织增生,心肌细胞明显减少,提示心肌梗死区形成。4.细胞移植组心脏标本HE染色示左心室前壁有结缔组织增生,形状不规则,其中有成纤维细胞,有异源性细胞;心梗模型组、DMEM培养液移植组标本HE染色可见疤痕组织,未发现异常细胞。假手术组未发现疤痕组织和异常细胞。在细胞移植组心脏标本中发现标记的荧光细胞,在心梗模型组、DMEM培养液移植组心脏标本中未发现标记细胞,在假手术组心脏标本中未发现标记细胞。移植细胞组结蛋白染色阳性,肌钙蛋白I染色阳性,提示移植的细胞向心肌样细胞分化趋势,并且激活Notch信号的BMMSCs移植组抗体阳性表达明显高于单纯BMMSCs移植组。心脏彩色多普勒超声检查发现细胞移植后4周,心肌局部运动功能障碍消失,心腔缩小,左心室射血分数升高。统计学分析表明,激活Notch信号的BMMSCs移植组大鼠心功能与BMMSCs移植、心梗模型组和DMEM培养液移植组相比,明显改善。与BMMSCs移植、心梗模型组和DMEM培养液移植相比,激活Notch信号的BMMSCs移植组大鼠心脏的心肌梗死范围明显减小,心室壁厚度明显增加,毛细血管密度明显增加,VEGF蛋白表达明显增多,I型胶原抗体、基质金属蛋白酶-1抗体表达明显减轻。结论激活Notch信号的BMMSCs移植及单纯BMMSCs移植细胞可在心肌内存活,并分化为心肌样性细胞,高效表达VEGF蛋白,梗死区新生血管形成增加,心脏胶原、基质金属蛋白酶合成降低,心脏重构减轻,心功能明显改善。激活Notch信号的BMMSCs移植治疗心肌梗死是有效的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英汉缩略语对照表
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和诱导
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞激活Notch信号通路
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 第三部分 激活Noth信号的骨髓间充质干细胞移植改善心脏功能及心脏重构
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果