IL-10基因修饰的大鼠肝细胞对肝星状细胞的影响及其可能机制

论文摘要

目的研究大鼠肝细胞及白细胞介素-10（IL-10）对原代肝星状细胞（HSC）增殖、活化及凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法用RT-巢式PCR方法获取大鼠IL-10基因的全长编码序列,采用分子克隆技术构建其真核表达载体pcDNA3.0-rIL-10,并进行双酶切法及测序鉴定。通过有或无去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体将重组质粒转染大鼠肝细胞系BRL,采用RT-PCR及ELISA方法观察IL-10 mRNA和分泌型IL-10蛋白的表达情况,用MTT法及流式细胞分析法检测转染空质粒和重组质粒的BRL细胞的增殖、凋亡情况。分别将正常的、转染pcDNA3.0空质粒及转染pcDNA3.0-rIL-10质粒的BRL细胞与原代HSC共培养,通过相差显微镜下观察、MTT、原位末端标记检测（TUNEL）、western blot等方法观察各组HSC的表型变化、增殖、凋亡、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及I型前胶原的表达。用抗体芯片技术检测各组BRL细胞的培养上清液中细胞因子的表达差异。结果成功构建重组质粒pcDNA3.0-rIL-10,并转染BRL细胞,获得高水平的IL-10表达,而后者抑制了BRL细胞的凋亡。发现受体介导的脂质体转染效率明显高于非受体介导的脂质体。BRL细胞显著促进HSC的增殖、凋亡以及α-SMA和I型前胶原的表达,使HSC的脂滴消失加速,收缩性增强。IL-10则抑制HSC的增殖、以及α-SMA和I型前胶原的表达,进一步促进HSC的凋亡。抗体芯片显示,BRL细胞的培养上清液中血管内皮生长因子（VEGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP-1）等三种细胞因子显著上调,转染pcDNA3.0-rIL-10质粒的BRL细胞较之转染空质粒者IL-10显著上调,VEGF下调。结论受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性,可能成为IL-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体。肝细胞促进HSC的增殖与活化,其机制可能与其表达VEGF、MCP-1、TIMP-1等细胞因子有关。IL-10可抑制HSC的增殖与活化,促进HSC凋亡,其机制除直接作用于HSC,还可能通过抑制肝细胞表达VEGF而间接作用。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、前言
• 四、正文
• 第一部分 大鼠IL-10 基因真核表达载体的构建及鉴定
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二部分 重组质粒pcDNA3.0-rIL-10 在肝细胞中的表达
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第三部分 IL-10 基因修饰的大鼠肝细胞对肝星状细胞的影响--
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第四部分 肝细胞及IL-10 影响肝星状细胞活化的可能机制
• 1. 材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 五、结论
• 六、 参考文献
• 七、 综述
• 八、 致谢