牛卵泡卵母细胞冷冻保存的研究

论文摘要

本试验以屠宰场废弃牛卵巢为材料,从卵巢表面直径在2～8 mm的卵泡中抽取卵泡液,并从卵泡液中分拣出外被多层卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体（COCs）作为研究的对象。本试验首先对影响牛COCs冷冻的一些因素进行了探讨,然后用荧光染色的方法分析了冷冻对COGs减数分裂进程的影响。 1 影响牛COCs冷冻保存的一些因素的研究 试验首先在简化牛COCs体外成熟的基础土分析了保护剂、平衡温度、预平衡方法、解冻方法以及冷冻方法对牛COCs冷冻的影响。结果表明:（1） 在体外成熟培养液中添加26.2mM的NaHCO3和对屠宰场卵巢进行一定的选择更能促进牛COCs的体外成熟;（2） 无论是程序冷冻还是玻璃化冷冻,乙二醇（EG）与甘油（GLY）相比更能增强牛COGs的冷冻效果;（3） 在程序冷冻中,冷冻液中添加0.1M的蔗糖比添加0.3M的蔗糖更能增强牛COCs的冷冻效果;（4） 在玻璃化冷冻中,38.5℃和25℃的平衡温度比4℃更适合牛COCs的冷冻;（5） 在10%、5%、1%的预平衡浓度之间,5%的预平衡浓度即可达到预平衡的效果;（6） 在解冻时,多步脱除保护剂较一步脱除法更能保护冷冻后的COGs;在比较几种最小样本量（minimum size sample,MSS）玻璃化冷冻方法时,解冻成熟培养后比较成熟率发现,拉细毛细玻璃管（pullcd glass micropipette）冷冻法（41.67%±3.19%）极显著高于未拉细毛细玻璃管冷冻法（glass micropipette）（30.19%±1.93%）和固体表面冷冻法（solid surface vitriflcation,SSV）（28.33%±2.89%）,（P<0.01）。 2 用荧光染色的方法分析冷冻对牛COCs减数分裂进程的影响 试验通过荧光染色的方法建立了卵母细胞在体外培养过程中第一次减数分裂的各个阶段的判断标准;然后根据这个标准来观察GMP玻璃化冷冻（20%乙二醇+20%甘油+0.5M蔗糖）对卵母细胞第一次减数分裂进程的影响。从屠宰场废弃的卵巢表面卵泡内抽取卵泡液,挑选多层卵丘包围的COCs进行体外培养;此时有70%卵母细胞处于生发泡期（GV）,12.5%的卵母细胞生发泡开始破裂,7.5%已开始浓缩,这说明从屠宰场获得的卵母细胞有较高的异质性。体外培养8h后,冷冻组到达中期（MI）的卵母细胞显著少于对照组（未冷冻组）（P<0.01）,其他阶段的卵母细胞没有显著的差异;体外培养15h后,冷冻组有16.67%的卵母细胞到达了MI期,显著低于对照组的38.89%（P<0.05）,另外,对照组有36.11%（19.44%,16.67%）的卵母细胞到达了后期（AI）和第二次减数分裂中期（MII）,而冷冻组仅6.67%的卵母细胞到达

论文目录

• 摘要
• 缩略语
• 文献综述部分
• 哺乳动物卵母细胞冷冻保存的研究进展
• 1 卵母细胞冷冻保存的意义
• 2 卵母细胞冷冻保存的发展
• 3 卵母细胞冷冻保存的原理及保护剂
• 3.1 卵母细胞冷冻保存的原理
• 3.2 冷冻保护剂
• 4 卵母细胞冷冻保存的方法
• 4.1 改进的慢速冷冻法
• 4.2 玻璃化冷冻法
• 参考文献
• 试验研究部分
• 第一章 影响牛卵泡卵母细胞冷冻保存因素的研究
• 1 材料、方法与试验设计
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 试验设计
• 1.4 结果统计分析
• 2 结果
• 2.1 不同缓冲方法对牛COCs体外成熟的影响
• 2.2 卵巢状态对牛COCs体外成熟的影响
• 2.3 蔗糖对牛COCs程序冷冻的影响
• 2.4 冷冻保护剂对牛COCs玻璃化冷冻影响
• 2.5 平衡温度对牛COCs玻璃化冷冻的影响
• 2.6 预平衡中冷冻保护剂的浓度对牛COCs玻璃化冷冻的影响
• 2.7 不同解冻方法对牛COCs玻璃化冷冻的影响
• 2.8 几种最小样本量玻璃化冷冻方法的比较
• 3 讨论
• 3.1 培养液中不同缓冲系统对成熟培养的影响
• 3.2 屠宰场卵巢形态上的选择对成熟培养的影响
• 3.3 蔗糖对牛COCs程序冷冻效果的影响
• 3.4 冷冻保护剂对牛COCs玻璃化冷冻效果的影响
• 3.5 平衡温度对牛COCs玻璃化冷冻效果的影响
• 3.6 预平衡中冷冻保护剂浓度对牛COCs玻璃化冷冻效果的影响
• 3.7 不同解冻方法对牛COCs玻璃化冷冻效果的影响
• 3.8 玻璃化冷冻方法对牛COCs玻璃化冷冻的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 第二章 用荧光染色的方法探讨GMP玻璃化冷冻对牛COCs体外减数分裂进程影响的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 各减数分裂阶段的判断标准的建立
• 2.2 牛未冷冻COCs减数分裂进程
• 2.3 冷冻对牛COCs减数分裂进程的影响
• 2.4 牛冷冻和未冷冻COCs减数分裂进程的比较
• 3 讨论
• 3.1 用荧光染色方法建立减数分裂各阶段的判断标准
• 3.2 冷冻对减数分裂进程的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 总体结论
• 图版
• 图版说明
• 致谢