高密度培养盘基网柄菌及重组可溶性人Fas配体表达的研究

论文摘要

盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）,又称为阿米巴虫是一种简单的原生动物。它的细胞个体（直径5-10μm）大于微生物,生长速率高于动物细胞,培养基中不需要添加血清,更重要的是,它们具有类似于高等动物的蛋白糖基化修饰能力。因此在作为宿主细胞表达复杂的重组药用蛋白（特别是糖蛋白）方面,有广阔的应用前景,但也存在着细胞密度及蛋白质表达水平低等问题有待于解决。本论文通过对摇瓶和发酵罐培养条件的优化提高了盘基网柄菌培养密度,并建立了模拟细胞生长规律的生长动力学模型。进行了盘基网柄菌固定化培养研究,研制了以聚氨酯泡沫、棉纤维织物为固定化载体的固定化生物反应器。同时以可溶性人Fas配体（shFasL）作为示例蛋白,对重组表达系统进行了基因工程改造,考察了可溶性人Fas配体生产的工艺条件,并对其分离及纯化工艺进行了初步探索。通过摇瓶培养条件的单因素优化,确定盘基网柄菌AX3-pLu8的最佳培养条件为:温度22℃,pH 6.5,摇床转速150rpm,培养时间100-120小时左右;培养基最佳碳源为葡萄糖,最佳葡萄糖浓度为15g/l。通过在HL-5C培养基中分别添加0.2g l-1色氨酸和0.4g l-1半胱氨酸显著提高最高细胞密度。在上述优化条件下,最高细胞密度达到了3.5×107ml-1。在此基础上,在5L发酵罐上对分批发酵培养盘基网柄菌进行了考察,确定最优批次发酵条件为pH6.5,通气量1vvm,根据菌体生长情况分阶段改变转速,在最优条件下,菌体的对数生长期被有效地延长到了70小时,最高菌体密度达到3.7×107ml-1。对盘基网柄菌的生长动力学进行了研究,建立了一个四参数逻辑方程生长动力学模型,完整地模拟了盘基网柄菌细胞生长直至死亡的全过程。在摇瓶条件下,分别考察了利用聚氨酯泡沫以及棉纤维织物作为载体固定化盘基网柄菌的培养,在此研究的基础上,研制了以聚氨酯泡沫为固定化载体的旋转式生物反应器和以棉纤维织物为固定化载体的纤维床生物反应器（旋转式、外循环式）。在聚氨酯泡沫旋转式生物反应器中最高菌体密度达到了4.2×107ml-1,在旋转式纤维床生物反应器中固定化细胞密度最高达到8.2×107mL-1,而在外循环式纤维床生物反应器中固定化细胞密度进一步提高到了1.37×108mL-1,远高于普通悬浮培养时1～2×107ml-1的平均细胞密度。对原有的盘基网柄菌重组表达系统进行改造,构建了带有His-tag的重组pMB74-shFasL-H质粒载体,并转入盘基网柄菌AX3宿主菌进行表达,目的蛋白shFasL的表达量达到了157.8μg l-1。而在外循环式纤维床反应器固定化培养条件下,shFasL的表达量可进一步提高到173.7μg l-1,在此基础上进行的重复批次发酵实现了在360小时中shFasL的持续表达,且发酵过程中细胞密度、蛋白产率均没有明显下降。对产物shFasL的分离纯化进行了初步研究,最终获得的重组蛋白的纯度可达到91.0%,回收率达到了92.1%。此外,在攻读博士学位期间,本人还参与了国家“863”计划目标导向项目“微生物高效生产聚谷氨酸功能材料的新技术和新工艺”的部分研究工作,对原有的γ-聚谷氨酸发酵生产工艺和培养基配方进行了改进,大幅度降低了γ-聚谷氨酸发酵的氮源成本,成功地进行了100 L规模发酵罐的中师放大实验,γ-聚谷氨酸产量达到了54 g l-1,为工业规模生产γ-聚谷氨酸打下了坚实的基础。这部分内容单独列于本论文的附录中。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 盘基网柄菌的生物学特征
• 1.1.1 盘基网柄菌的生命周期
• 1.2 盘基网柄菌的基因组
• 1.3 盘基网柄菌的培养
• 1.3.1 细菌培养
• 1.3.2 无菌培养
• 1.3.2.1 常用无菌培养菌株
• 1.3.2.2 无菌培养基
• 1.3.2.3 盘基网柄菌营养生长的抑制因素
• 1.4 盘基网柄菌的高密度发酵
• 1.4.1 常见的高密度发酵方法
• 1.4.1.1 补料-分批培养
• 1.4.1.2 膜截流的循环培养
• 1.4.1.3 固定化培养
• 1.4.1.4 纤维床生物反应器研究进展
• 1.4.2 盘基网柄菌高密度发酵研究进展
• 1.4.2.1 盘基网柄菌的补料分批培养
• 1.4.2.2 盘基网柄菌的微过滤截留培养
• 1.4.2.3 盘基网柄菌的固定化培养
• 1.5 盘基网柄菌表达系统
• 1.5.1 盘基网柄菌表达蛋白的糖基化结构特点
• 1.5.2 盘基网柄菌表达系统的优点
• 1.5.3 盘基网柄菌系统表达异源蛋白质的研究进展
• 1.5.3.1 寄生生物糖蛋白
• 1.5.3.2 病毒蛋白
• 1.5.3.3 人类蛋白
• 1.5.4 重组盘基网柄菌表达人可溶性Fas配体
• 1.5.4.1 细胞凋亡与可溶性人Fas配体（shFasL）
• 1.5.4.2 重组人FasL的生产
• 1.6 本工作的研究基本思路及拟研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 菌种与质粒
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 抗体
• 2.2.3 工具酶及试剂盒
• 2.2.4 主要试剂
• 2.3 培养基和培养条件
• 2.3.1 主要培养基与缓冲液
• 2.3.1.1 大肠杆菌培养基
• 2.3.1.2 盘基网柄菌培养基
• 2.3.1.3 缓冲液
• 2.3.2 培养条件
• 2.3.2.1 菌种保藏
• 2.3.2.2 菌种活化
• 2.3.2.3 悬浮培养条件
• 2.3.2.4 分批培养条件
• 2.4 分析测定方法
• 2.4.1 pH测定
• 2.4.2 细胞密度的测定
• 2.4.3 葡萄糖浓度的测定
• 2.4.3.1 DNS法
• 2.4.3.2 酶电极测定
• 2.4.4 分子克隆相关实验
• 2.4.5 盘基网柄菌染色体外质粒（穿梭质粒）的提取与鉴定
• 2.4.6 盘基网柄菌染色体外质粒的电转化
• 2.4.7 SDS-PAGE蛋白电泳
• 2.4.8 Western-blot分析
• 2.4.9 重组可溶性人Fas配体（FasL）浓度的测定
• 2.4.10 扫描电镜样品制备方法
• 第三章 盘基网柄菌培养条件优化及生长动力学
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 菌种
• 3.2.1.2 培养基
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 培养方法
• 3.2.2.2 AX3-pLu8生长曲线的测定
• 3.2.2.3 培养条件优化
• 3.2.2.4 氨基酸的影响
• 3.2.2.5 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 盘基网柄菌的摇瓶发酵条件优化
• 3.3.1.1 盘基网柄菌AX3-pLu8的生长曲线
• 3.3.1.2 培养温度对菌体生长的影响
• 3.3.1.3 摇床转速对盘基网柄菌生长的影响
• 3.3.1.4 pH值对盘基网柄菌生长的影响
• 3.3.1.5 碳源种类对盘基网柄菌生长的影响
• 3.3.1.6 碳源浓度对盘基网柄菌生长的影响
• 3.3.1.7 添加氨基酸对于盘基网柄菌生长的影响
• 3.3.1.8 氨基酸添加量对盘基网柄菌生长的影响
• 3.3.2 盘基网柄菌的分批发酵条件优化
• 3.3.2.1 pH对分批发酵过程的影响
• 3.3.2.2 通气量对分批发酵过程的影响
• 3.3.2.3 搅拌转速对分批发酵过程的影响
• 3.3.3 盘基网柄菌的生长动力学研究
• 3.4 小结
• 第四章 盘基网柄菌固定化及新型固定化细胞反应器研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.1.1 菌种
• 4.2.1.2 培养基与缓冲液
• 4.2.1.3 固定化载体材料
• 4.2.1.4 旋转式生物反应器
• 4.2.1.5 纤维床生物反应器（FBB）
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 培养方法
• 4.2.2.2 菌体密度测定
• 4.2.2.3 固定化载体上吸附情况的测定
• 4.2.2.4 葡萄糖浓度的测定
• 4.2.2.5 扫描电镜观察
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 利用聚氨酯泡沫固定化培养盘基网柄菌
• 4.3.1.1 盘基网柄菌在聚氨酯泡沫固定化载体上的吸附
• 4.3.1.2 聚氨酯泡沫载体尺寸和形状对固定化培养的影响
• 4.3.1.3 聚氨酯泡沫添加量对固定化培养的影响
• 4.3.1.4 聚氨酯泡沫固定化培养盘基网柄菌
• 4.3.1.5 利用旋转式生物反应器PUF固定化培养盘基网柄菌
• 4.3.2 利用棉纤维织物固定化培养盘基网柄菌
• 4.3.2.1 棉纤维织物的选择
• 4.3.2.2 棉纤维织物添加量对吸附效果的影响
• 4.3.2.3 盘基网柄菌在棉纤维织物上的吸附
• 4.3.2.4 棉纤维织物直接固定化培养盘基网柄菌
• 4.3.2.5 棉纤维织物分段式固定化培养盘基网柄菌
• 4.3.2.6 棉纤维织物固定化培养盘基网柄菌的扫描电镜观察
• 4.3.3 利用旋转式纤维床生物反应器（RFBB）固定化培养盘基网柄菌
• 4.3.3.1 单层棉纤维织物载体纤维床
• 4.3.3.2 单层棉纤维织物填充PUF纤维床
• 4.3.4 利用纤维床生物反应器（FBB）固定化培养盘基网柄菌
• 4.3.4.1 棉纤维织物填充量对固定化培养的影响
• 4.3.4.2 纤维床容积对固定化培养的影响
• 4.4 小结
• 第五章 在盘基网柄菌中重组表达可溶性人Fas配体
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.1.1 菌种
• 5.2.1.2 质粒
• 5.2.1.3 PCR引物
• 5.2.1.4 培养基
• 5.2.1.5 工具酶及试剂盒
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 盘基网柄菌染色体外质粒的提取
• 5.2.2.2 PCR反应扩增shFasL基因并添加His-Tag
• 5.2.2.3 PCR产物的回收及鉴定
• 5.2.2.4 表达载体构建
• 5.2.2.5 表达载体电转化入盘基网柄菌
• 5.2.2.6 培养方法
• 5.2.2.7 发酵液预处理
• 5.2.2.8 亲和层析
• 5.2.2.9 目标蛋白的浓缩
• 5.2.2.10 SDS-PAGE蛋白电泳及Western Blot分析
• 5.2.2.11 可溶性hFasL浓度的ELISA方法测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 pMB74质粒的获得
• 5.3.2 His-tag的引入
• 5.3.3 pMB74-shFasL-H载体的构建及转化
• 5.3.4 重组shFasL蛋白的表达
• 5.3.5 重组蛋白shFasL表达的初步优化
• 5.3.5.1 HL-5C培养基碳氮源含量的影响
• 5.3.5.2 HL-5C培养基pH对重组蛋白表达的影响
• 5.3.6 利用FBB固定化盘基网柄菌表达重组shFasL
• 5.3.6.1 单一批次FBB固定化培养
• 5.3.6.2 重复批次FBB固定化培养
• 5.3.7 亲和层析分离重组蛋白shFasL
• 5.3.7.1 丙酮沉淀浓缩及SDS-PAGE电泳鉴定
• 5.3.7.2 Western blot鉴定
• 5.4 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望
• 附录 γ-聚谷氨酸发酵的优化与放大
• 7.1 引言
• 7.2 微生物发酵生产γ-PGA的研究进展
• 7.3 材料与方法
• 7.3.1 实验材料
• 7.3.1.1 菌种
• 7.3.1.2 培养基
• 7.3.2 实验方法
• 7.3.2.1 培养方法
• 7.3.2.2 培养条件优化
• 7.3.3 分析方法
• 7.3.3.1 菌体密度测定
• 7.3.3.2 发酵液粘度测定
• 7.3.3.3 谷氨酸及葡萄糖浓度测定
• 7.3.3.4 γ-PGA的测定
• 7.4 结果与讨论
• 7.4.1 γ-PGA发酵培养基的氮源优化
• 7.4.2 γ-PGA发酵接种时间的优化
• 7.4.3 γ-PGA发酵初始碳源浓度的优化
• 7.4.4 γ-PGA发酵的放大
• 7.5 小结
• 参考文献
• 作者简历
• 论文发表情况