论文题目: 骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 内科学
作者: 贾敏
导师: 曾秋棠
关键词: 间充质干细胞,氮胞苷,诱导,心肌细胞,移植,心肌梗死,心功能,间质干细胞,阿托伐他汀,联合,应用
文献来源: 华中科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化为心肌细胞的研究 目的 观察MSCs的生物学特性，探讨5-氮胞苷（5-aza）诱导MSCs向心肌细胞分化的机制。 方法 无菌分离大鼠下肢长骨，密度梯度离心法获取骨髓细胞，用含15％胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培养液培养，通过贴壁筛选法纯化MSCs。细胞生长达80％以上融合时，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，进行传代、扩增。第二代MSCs传代48小时后，四个实验组分别加入不同浓度的5-aza，作用24小时；对照组不加任何诱导剂。用免疫细胞化学法检测诱导后1、2、3周各组细胞对α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、连接蛋白43（Cx-43）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达；通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测MSCs是否分化为心肌细胞。 结果 （1）接种后，MSCs贴壁生长，呈长梭形、多角形等；随着不断换液MSCs得到纯化。原代细胞10-12天达到传代标准。（2）MSCs具有活跃的增殖能力，传代后细胞生长较快，第6-7天生长达到高峰。（3）MSCs经5-aza诱导后，细胞体积增大，形态不规则。（4）免疫细胞化学检测显示5μM组2、3周、10μM组2周细胞α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43、心肌肌钙蛋白T阳性表达较少；10μM组3周有较多阳性表达。50μM组大部分细胞在培养过程中死亡，弃去。其余未见阳性表达。（5）RT-PCR显示经5μM、10μM的5-aza诱导后2、3周的细胞分别扩增出与目的基因一致的扩增带，表明可表达心肌肌钙蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白。其余未能出现扩增带。 结论 骨髓MSCs易于体外培养、扩增，含15％胎牛血清的L-DMEM培养液符合MSCs生长需要。MSCs具有多向分化潜能，在合适的诱导条件下可分化为心肌细胞。5-aza可诱导MSCs向心肌细胞分化，最合适的诱导浓度为10μM，作用时间24小时。 第二部分 骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死作用的研究 目的 观察同种异体MSCs移植到大鼠心肌梗死区后的增殖、分化情况，研究MSCs移植对梗死心肌和心功能的作用，探讨其机制，为细胞移植治疗急性心肌梗死提供新的种子细胞。 方法 用成年大鼠结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。2周后再次开胸，在梗死心肌周围及中央，三个实验组分别移植L-DMEM培养液、PBS和预先用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记的MSCs。移植前、移植4周后进行超声学检测，了解心功能情况。第二次超声学检测后，处死并取出心脏行常规组织脱水，石蜡包埋，5μm厚连续切片，分别进行HE染色和免疫组织化学染色，观察心肌梗死区细胞及组织学变化。 结果 （1）培养液组和PBS组大鼠的心功能逐渐恶化；MSCs移植组心功能与移植前、同期培养液组和PBS组比较有明显改善（P＜0.05）。（2）MSCs移植组梗死心肌内有BrdU标记阳性移植细胞。（3）MSCs移植到梗死区4周后表达心肌细胞特异性蛋白。结论 MSCs移植到心肌损伤部位后，能够存活和增殖，在心脏微环境作用下，能分化成心肌细胞。MSCs移植能够修复梗死心肌和改善心功能，是治疗急性心肌梗死可以选择的种子细胞。 第三部分 间充质干细胞移植合并阿托伐他汀应用治疗急性心肌梗死的研究 目的 观察单纯MSCs移植、MSCs移植合并阿托伐他汀应用对急性心肌梗死心功能的不同影响，探讨阿托伐他汀对细胞移植、心肌梗死的作用机制，为提高细胞移植治疗心肌梗死的疗效而提供依据。 方法 建立急性心肌梗死模型，分成四个实验组。培养液对照组：梗死部位注射L-DMEM培养液。阿托伐他汀组：梗死部位注射L-DMEM培养液；术后阿托伐他汀10mg／kg.d溶入生理盐水2ml，灌喂。MSCs移植组：将已标记的MSCs移植到梗死部位4个点，50μl／点（细胞数量2×106个）。MSCs移植合并阿托伐他汀应用组：将已标记的MSCs移植到梗死部位4个点，50μl／点；术后阿托伐他汀10mg／kg.d，灌喂。4周后，分别进行超声学检测，了解心功能情况，计算左室射血分数（EF％）和短轴缩短率（FS％）；经颈部腹侧偏右切口，分离右侧颈总动脉，通过压力换能器连接多道电生理记录仪，记录血流动力学指标左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室压力变化最大速率(±dp／dtmax)；应用免疫组织化学法检测心肌组织中细胞和组织形态学变化。 结果 （1）MSCs移植组、MSCs移植合并阿托伐他汀应用组与培养液对照组、阿托伐他汀组比较左心室容积、左室射血分数、短轴缩短率均明显升高（P＜0.05），且MSCs移植合并阿托伐他汀应用组升高更明显（P＜0.05）。（2）培养液对照组、阿托伐他汀组左室前壁运动减弱；MSCs移植组、MSCs移植合并阿托伐他汀应用组左室前壁运动增强，且MSCs移植合并阿托伐他汀应用组左室前壁运动增强更明显（P＜0.05）。（3）MSCs移植组、MSCs移植合并阿托伐他汀应用组与培养液对照组、阿托伐他汀组比较LVSP、±dp／dtmax均升高（P＜0.05），LVEDP降低（P＜0.05），且MSCs移植合并阿托伐他汀应用组的改变程度大于MSCs移植组（P＜0.05）。（4）对照组、阿托伐他汀组梗死区心肌纤维化明显，细胞排列紊乱。MSCs移植组、MSCs移植合并阿托伐他汀应用组的梗死心肌内均可见BrdU标记阳性细胞分布，并像心肌细胞一样平行排列。（5）大部分抗BrdU染色阳性的细胞心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43表达阳性。 结论 阿托伐他汀具有能够抑制炎症反应、改善血管内皮细胞功能、抑制血小板血栓形成、改善梗死后心肌组织血供等作用，改善移植细胞生存的微环境，促进MSCs存活并分化为心肌细胞。MSCs移植联合阿托伐他汀应用治疗急性心肌梗死有协同提高疗效作用，能够更大程度的改善急性心肌梗死的心功能，其效果明显优于单纯MSCs移植。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
参考文献
第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化为心肌细胞的研究
材料与方法
结果
讨论
参考文献
第二部分 骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死作用的研究
材料与方法
结果
讨论
参考文献
第三部分 间充质干细胞移植合并阿托伐他汀应用治疗急性心肌梗死的研究
材料与方法
结果
讨论
参考文献
小结
综述 骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的研究进展
参考文献
缩略词表
致谢
发布时间: 2007-06-20
参考文献
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