人nthESC向HSC诱导分化和胚胎造血标志物表达研究

论文题目: 人nthESC向HSC诱导分化和胚胎造血标志物表达研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 王跃嗣

导师: 范光丽,李建远

关键词: 造血诱导,胚胎

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是近年来研究较多的一类组织干细胞,目前发现卵黄囊、胎肝、主动脉-性腺-中肾区(AGM)、胎儿血液以及胎盘中均存在具有高度扩增能力的HSC。本论文主要进行了具有课题组专利的人自体基因胚胎干细胞(nthESC)向造血干细胞的诱导分化、人胚胎发育过程中卵黄囊、胎肝和胎盘中的造血发育以及胎盘贴壁细胞的分离培养、向神经细胞诱导分化的研究,为nthESC 和HSC的临床应用提供了理论依据和技术方法。1. 探讨了人胚骨髓间充质干细胞(MSC)的体外分离、扩增、冻存、复苏、转GFP基因和向成骨和神经细胞的诱导分化条件,结果发现MSC有60%可转染GFP基因,表达CD29、CD13、CD59,而CD34、CD45和CD38表达阴性。Vimentin染色阳性,mallory染色显示胶原存在,分离的细胞可在神经诱导体系和成骨诱导体系下进一步向神经细胞和成骨细胞分化。表明MSC在体外能迅速扩增,具有向成骨和神经细胞分化潜能,可以作为稳定饲养层来源。2. 利用人MSC 与人nthESC 共培养,研究人MSC 对胚胎干细胞诱导造血的作用并建立一种有效诱导nthESC 为HSC 的方法。经过20 d 培养,获得大量的CD133+和CD34+绿色荧光标记的HSC。来源于nthESC 的KDR+细胞首先出现在第5 天,CD133 随后出现,CD34+细胞出现在第7 天,随时间延长三者表达增强,第11 天左右表达最强,随后减弱,20 d 仍有表达。培养中发现11 d 可形成小造血集落,14 d 形成大集落。在BMP4、FGF-1和VEGF 等因子作用下,可促进造血细胞形成。结果显示由nthES 与MSC 共培养可产生CD34+细胞,nthESC 的造血分化程序为先形成KDR+细胞,其次是CD133+,再形成CD34+细胞。表明nthESC 可在人胚骨髓MSC 饲养层上有效诱导成HSC。3. 采用分阶段悬浮培养法,首先诱导nthESC 形成拟胚体(EB),在此过程中添加BMP4 和FGF-1。第二阶段,打散EB,再添加VEGF 和其他细胞因子,对HSC 进行扩增。结果发现,采用低黏附板可有效促进EB 形成,BMP4 和FGF-1 可使EB 形成数量明显增加,可使KDR+和CD133+荧光细胞数量明显增多。添加VEGF 等细胞因子,可有效促进CD34+细胞数量增加。结果表明,联合使用BMP4、FGF-1、VEGF 和SCF 等细胞因子,可使悬浮培养形成EB 数量增加,产生更多的造血前体细胞,继而产生大量HSC。

论文目录:

摘要

Abstract

前言

缩写中英文对照

第一部分:文献综述

第一章 造血干细胞的研究进展

1.1 造血干细胞的概念

1.2 造血干细胞的起源

1.3 造血干细胞的形态

1.4 造血干细胞的表面标志

1.4.1 CD133(或 AC133)

1.4.2 CD34

1.4.3 c-kit

1.4.4 Sca-1

1.4.5 Thy-1

1.5 造血干细胞的可塑性

1.6 造血干细胞的临床应用

第二章 哺乳动物胚胎造血的研究进展

2.1 卵黄囊中起始原始造血

2.2 成熟和永久造血的形成

2.3 造血干细胞的迁移

2.4 造血干细胞的归巢

2.5 成血管血液干细胞

2.5.1 原始造血过程中的成血管血液干细胞

2.5.2 永久造血过程中的成血管血液干细胞

2.5.3 成血管血液干细胞的多潜能

2.5.4 影响胚胎造血的因素

2.6 胎盘造血的研究进展

2.6.1 胎盘初期造血灶的出现

2.6.2 胎盘含有大量的造血干细胞

2.6.3 胎盘可分泌许多造血相关因子

2.6.4 胎盘贴壁细胞的培养与生物学特性

2.6.5 胎盘造血的展望和存在的问题

第三章 ESC 体外向造血系统的分化研究概况

3.1 人胚胎干细胞系的建立

3.2 ESC 向造血细胞体外分化的方法分类

3.2.1 EB 形成法

3.2.2 ESC 与造血基质细胞系共培养法

3.3 ESC 体外分化为造血细胞

3.3.1 利用饲养层对 ESC 进行造血诱导

3.3.2 EB 诱导造血形成

3.3.3 影响 EB 造血诱导的一些因素

3.4 分化的 ESC 在小鼠体内重建造血

3.5 ESC 向造血干细胞/祖细胞诱导分化调控

3.5.1 造血相关因子对胚胎造血和造血干细胞的影响

3.5.2 造血过程中的转录调控

3.6 人 ES 细胞向 HSC 定向诱导分化的应用前景

3.7 存在问题及展望

参考文献

第二部分:试验研究

第四章 人胚骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

1 材料

1.1 人胎儿骨髓

1.2 试剂

1.3 抗体

1.4 仪器

2 方法

2.1 人胚骨髓间充质细胞的分离培养

2.2 骨髓间充质细胞的生物学特性鉴定

2.2.1 hMSCs 的生长曲线的测定

2.2.2 hMSCs 的冻存和复苏

2.2.3 hMSCs 转 GFP 基因

2.2.4 hMSCs 定向诱导分化为神经细胞

2.2.5 hMSC 向成骨诱导

2.2.6 hMSC 的表面抗原检测

2.3 免疫组织化学 SP 法

3 结果

3.1 人胚骨髓间充质干细胞的分离培养

3.2 人胚骨髓间充质干细胞生物学特性

3.2.1 hMSCs 细胞的生长曲线

3.2.2 hMSCs 的冻存和复苏

3.2.3 hMSCs 转染 GFP 基因

3.2.4 hMSC 向神经元样细胞的定向诱导分化

3.2.5 hMSC 向成骨细胞定向诱导

3.2.6 hMSC 的表面抗原检测

4 讨论

5 小结

参考文献

第五章 人骨髓间充质干细胞与 nthESC 共培养对造血分化的研究

1 材料

1.1 细胞株

1.2 hMSCs 饲养层

1.3 试剂

1.4 抗体

1.5 仪器

2 方法

2.1 免疫荧光

2.2 免疫组织化学 SP 法

2.3 nthES 细胞诱导分化成造血前体细胞

2.3.1 人骨髓间充质干细胞饲养层的制备

2.3.2 人 nthESC 的培养

2.3.3 nthESC 在 MSC 饲养层上诱导培养向造血分化

3 结果

3.1 与 MSC 共培养时 nthESC 的诱导形态观察

3.2 造血形成阶段相关抗体表达

4 讨论

4.1 造血干细胞表型的选择

4.2 hMSC 饲养层对 nthESC 向造血诱导的影响

4.3 nthES 细胞向 HSC 诱导分化过程中 KDR~+、CD133~+和 CD34~+细胞

5 小结

参考文献

第六章 悬浮培养 nthESC 向造血诱导分化研究

1 材料

1.1 细胞株

1.2 试剂

1.3 抗体

1.4 仪器

2 方法

2.1 悬浮培养诱导 nthESC 向造血分化

2.1.1 第一阶段: nthESC 细胞分化形成拟胚体(EB)

2.1.2 第二阶段:VEGF 支持 EB 生长和造血前体细胞分化

2.1.3 第三阶段:EB 细胞向造血分化

2.1.4 nthES 细胞分阶段诱导过程中细胞表面杭原的免疫细胞化学与荧光染色

2.2 EB 切片染色

3 结果

3.1 悬浮培养下拟胚体的形成

3.2 拟胚体向造血细胞的分化

3.2.1 EB 生长特性观察

3.2.2 nthES 分阶段诱导过程中细胞表面抗原的免疫组化和免疫荧光染色鉴定

4 讨论

4.1 悬浮培养体系中不同的细胞因子作用于 nthES 细胞成血分化的不同阶段

4.1.1 培养方法的选择

4.1.2 BMP4 和 FGF-1 对 nthES 细胞成血分化的作用

4.1.3 VEGF 对 EB 的形成和造血细胞的作用

4.2 nthES 细胞向 HSC 诱导分化过程中 KDR~+、CD133~+和 CD34~+细胞

5 小结

参考文献

第七章 人卵黄囊中造血前体细胞和造血相关因子时序表达研究

1 材料

1.1 卵黄囊

1.2 抗体

1.3 试剂

1.4 仪器

2 方法

2.1 免疫组织化学 SP 法

2.2 RT-PCR

2.2.1 总 RNA 的提取

2.2.2 RT-PCR

3 结果

3.1 CD34、CD133、c-kit 和 KDR 在卵黄囊中的表达

3.2 VEGF、BMP4、FGF-1 和 SCF 在卵黄囊中的表达

3.3 转录因子在卵黄囊中的表达

4 讨论

4.1 造血前体细胞、干/祖细胞在卵黄囊中的出现

4.2 造血相关因子在卵黄囊中的表达

4.3 转录因子在卵黄囊中的表达

5 小结

参考文献

第八章 人胎肝中造血干细胞和造血相关因子的时序表达研究

1 材料

1.1 人胎肝

1.2 试剂

1.3 抗体

1.4 仪器

2 方法

2.1 免疫组织化学方法

2.2 RT-PCR 方法

3 结果

3.1 CD34、CD133、c-kit 和 KDR 在胎肝中的表达

3.2 VEGF、BMP4、SCF 和 FGF-1 在不同胚龄胎肝中的表达

3.3 KDR、CD133、CD34 和 c-kit 染色强度和数量在不同胚龄胎肝中的 比较

3.4 VEGF、BMP4、SCF 和 FGF-1 染色强度和数量在三组胎肝中的比较

3.5 转录因子在三组胎肝中的表达

4 讨论

4.1 造血相关标记在肝中的表达

4.2 造血相关因子在胎肝中的表达及功能意义

4.3 转录因子在胎肝中的表达及其功能意义

5 小结

参考文献

第九章 人胎盘胚外绒毛膜造血和神经相关标志物的表达研究

1 材料

1.1 胎盘组织

1.2 7 月龄新鲜胎儿胎盘组织小叶

1.3 试剂

1.4 抗体

1.5 其他试剂和仪器

2 方法

2.1 胎盘绒毛膜组织切片免疫组织化学染色

2.2 流式细胞分析

2.3 胎盘贴壁细胞的分离培养

2.4 生长曲线及倍增时间的测定

2.5 碱性磷酸酶检测(AKP 染色)

2.6 体外诱导 hPDACs 向神经样细胞分化

3 结果

3.1 胎盘绒毛膜组织切片免疫组织化学染色

3.2 流式细胞分析

3.3 hPDACs 的形态学观察

3.4 胎盘贴壁细胞免疫细胞化学鉴定

3.5 AKP 染色

3.6 体外诱导胎盘贴壁细胞为神经样细胞

4 讨论

4.1 胎盘中含有大量造血干细胞,表达造血相关因子

4.2 胎盘中表达神经细胞标志物,hPDACs 可向神经细胞诱导

5.小结

参考文献

结论

进一步研究的课题

致 谢

个人简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

• [1].VEGF在骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化中的作用及分化机制研究[D]. 张秀英.吉林大学2004
• [2].骨髓与脂肪间质干细胞分离与诱导分化为成骨细胞的研究[D]. 马勇江.西北农林科技大学2004
• [3].人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究及差异表达基因的微阵列分析[D]. 郑心田.天津医科大学2006
• [4].骨髓间充质干细胞诱导分化和心肌内移植的实验研究[D]. 刘彦.山东大学2006
• [5].抑制消减杂交技术筛选骨髓间充质干细胞诱导分化前后差异表达基因[D]. 牟大鹏.吉林大学2007
• [6].骨髓间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化的实验研究[D]. 贾海燕.四川大学2007
• [7].人源羊水干细胞分离培养、生物学特性检测及诱导分化研究[D]. 王晗.西北农林科技大学2008
• [8].人胚胎干细胞传代培养和神经诱导分化过程中基因组遗传变异的动态变化[D]. 陈雪梅.郑州大学2013
• [9].Hath6调控内皮细胞分化与功能及其作用机制研究[D]. 房芳.中国人民解放军军事医学科学院2013
• [10].人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞向成熟的嗜碱性粒细胞诱导分化及其生物学特性的研究[D]. 古彦铮.苏州大学2012

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