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米多霉素生物合成机理的研究

2020-11-28阅读(170)

米多霉素生物合成机理的研究

论文摘要

米多霉素是一类肽核苷类抗生素,具有强烈的抑制植物白粉病的活性。本研究利用来自杀稻瘟菌素生物合成基因簇上的胞嘧啶核苷单磷酸水解酶基因blsM及其同源基因设计兼并引物,从生裂链轮丝菌ZJU5119的基因组文库中筛选出六个相互重叠的柯斯质粒,其中柯斯质粒14A6可以使异源宿主变铅青链霉菌合成米多霉素,表明其包含了米多霉素生物合成所必须的全部基因。对14A6进行序列测定,其插入序列全长43,561bp,通过FramePlot beta4.0预测,它包含41个开放阅读框。其中milA编码了胞嘧啶核苷单磷酸羟甲基化酶,敲除milA的生裂链轮丝菌突变株只产生去羟甲基米多霉素。MilB是BlsM的同源蛋白,milB的突变株丧失了产生米多霉素和去羟甲基米多霉素的能力。大肠杆菌融合表达的MilA蛋白能够专一的在胞嘧啶核苷单磷酸的C5位上引入羟甲基基团,而不接受胞嘧啶或胞嘧啶脱氧核苷单磷酸作为其底物;融合表达的MilB的酶动力学实验表明:它能够高效的水解羟甲基胞嘧啶核苷单磷酸成羟甲基胞嘧啶,同时也能够水解胞嘧啶核苷单磷酸形成胞嘧啶;在MilA和MilB共同作用下形成的羟甲基胞嘧啶和胞嘧啶的比例约为9:1,而生裂链轮丝的发酵产物中米多霉素的产量与去羟甲基米多霉素比例却只有3:1,这种不一致在UDP-葡萄糖醛酸转移酶MilC的动力学反应参数中得到了解释,MilC催化UDP-葡萄糖醛酸与胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶反应的Kcat/Km分别为: 0.5250±0.0019和0.2719±0.0012,表明其对胞嘧啶有着更高的催化效率,这部分抵消了MilB对羟甲基胞嘧啶强烈的偏好性。米多霉素生物合成中一个让人迷惑而又引人兴趣的问题是葡萄糖残基C6原子的来源。用稳定性同位素C13 6个碳原子全标记的精氨酸喂养生裂链轮丝菌,其发酵产物中发现了分子量为520的米多霉素,含量比本底水平增高5倍,而非标记的米多霉素分子量为514。同时,高分辨二级质谱数据中所有包含胍基侧链的断裂碎片都比未喂养的对应部分分子量增高了6,表明标记的6个碳原子在精氨酸或者其衍生物与葡萄糖醛酸缩合过程中全部保留了下来,脱羧反应去掉的是葡萄糖醛酸羧基碳。所以,米多霉素葡萄糖残基C6原子来源于精氨酸而不是葡萄糖。为了系统的提出米多霉素完整的生物合成途径,我们结合异源表达和系统突变,首先确定了米多霉素生物合成基因簇的左右两个边界分别位于orf-1-milA与milQ-orf+1之间,对其中包括的17个orf一一进行突变,除了milL突变没有影响之外,证明其它的16个基因与米多霉素的生物合成相关。milG编码的是一个新颖的Radical SAM家族蛋白,它是唯一一个氧化还原酶候选基因,负责羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸C4位上羟基氧化成羰基,在milG突变株的发酵液中,中间产物羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸大量积累,这充分证明了其功能就是负责这一步关键的催化反应,这也是第一次在核苷类抗生素生物合成中报道的新型氧化酶基因。分别敲除两个氨基糖苷类磷酸转移酶基因milE和milQ,突变株都丧失了产生米多霉素的能力,推测这两个磷酸转移酶可能负责糖上的C2-C3间双键的形成。可能编码天冬氨酸/酪氨酸/芳香族氨基酸类氨基转移酶的milM和编码二氢吡啶甲酸合酶的milN基因的突变株均不能够再产生米多霉素,MilM可能参与催化精氨酸α位的氨基转化成羰基而形成α-酮酸,而MilN则负责α-羰基与脱羧后的己糖碳负离子之间的缩合。编码degT/dnrJ/eryC1/strS类氨基转移酶的milD和编码可能的连接酶功能的milH突变株都丧失了产生米多霉素的能力,推测前者是负责C4位上羰基的转氨反应,后者负责将激活的丝氨酸连接到C4位的氨基上,形成类似肽键的酰胺键。而中断LuxR家族的转录调节因子基因milO也消除了米多霉素的生产,说明它可能是一个途径专一性的调节基因。MilJ显示与Ubiquitone的羟甲基化酶有一定的同源性,可能负责精氨酸的gamma羟化;而MilI可能负责了丝氨酸的活化;ABC transporter基因milP的突变株也不产米多霉素,它很可能是米多霉素的抗性基因;编码Major Facilitator Superfamily的基因milk的突变株还能够产生米多霉素,但产量降低,它可能与磷酸葡萄糖的转运有关。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 符号说明
  • 第一章 文献综述
  • 第1节 链霉菌简介
  • 第2节 核苷类抗生素
  • 2.1 核苷类抗生素分类
  • 2.2 核苷类抗生素的生物合成基因簇
  • 第3节 米多霉素研究背景与进展
  • 3.1 米多霉素（mildiomycin）的化学结构
  • 3.2 植物白粉病与米多霉素的应用
  • 3.3 提高米多霉素产量的研究
  • 3.4 米多霉素衍生物的生物合成
  • 3.5 羟甲基胞嘧啶合成的初步研究
  • 第二章 实验材料和方法
  • 第1节 实验材料
  • 1.1 菌株
  • 1.2 质粒
  • 1.3 培养基和化学试剂
  • 1.4 本实验所用的 PCR 引物
  • 第2节 实验方法
  • 第三章 米多霉素生物合成基因簇的克隆和异源表达
  • 第1节 米多霉素生物合成基因簇的克隆
  • 第2节 米多霉素生物合成基因簇在变铅青链霉菌中的表达
  • 第3节 米多霉素生物合成基因簇的序列测定和 ORF 预测
  • 第四章 米多霉素生物合成基因簇中几个重要基因功能的研究
  • 第1节 MilA和MilB负责羟甲基胞嘧啶和胞嘧啶的合成
  • 1.1 链轮丝菌 ZJU5119 中 milA 和 milB 的基因置换
  • 1.2 链轮丝菌 milA 和 milB 的基因置换突变株的米多霉素合成
  • 1.3 MilA 和 MilB 的表达和纯化
  • 1.4 体外分析 MilA 和 MilB 的作用
  • 1.5 MilB 的动力学参数研究
  • 1.6 MilA 和 MilB 功能的讨论
  • 第2节 糖基转移酶 MilC 负责羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸和胞嘧啶葡萄糖 醛酸的合成
  • 2.1 MilC 的生物信息学分析
  • 2.2 milC 的基因置换
  • 2.3 MilC 的原核表达与纯化
  • 2.4 体外分析 MilC 的酶活反应
  • 2.5 MilC 对胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶具有不同的酶动力学常数
  • 2.6 MilC 对胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶具有不同的酶动力学常数的意义
  • 第五章 通过同位素喂养和基因突变分析米多霉素的生物合成
  • 13C 标记的精氨酸喂养'>第1节13C 标记的精氨酸喂养
  • 第2节 通过基因突变分析米多霉素生物合成
  • 2.1 几个基因置换中间质粒的构建
  • 2.2 milG 的基因置换
  • 2.3 milD 的基因置换
  • 2.4 milM 的基因置换
  • 2.5 milN 的基因置换
  • 2.6 milO 的基因置换
  • 2.7 milQ 的基因置换
  • 2.8 milI 的基因置换
  • 2.9 milJ 的基因置换
  • 2.10 milP 的基因置换
  • 2.11 milK 的基因置换
  • 2.12 milL 的基因置换
  • 2.13 milF 的基因置换
  • 2.14 milE 的基因置换
  • 2.15 milH 的基因置换
  • 第六章 米多霉素生物合成途径的推导
  • 第1节 米多霉素生物合成基因簇的边界的确定
  • 第2节 米多霉素生物合成基因簇和杀稻瘟菌素生物合成基因簇的比较
  • 第3节 米多霉素生物合成途径的推导
  • 第七章 总结与展望
  • 第1节 本研究工作总结和主要创新点
  • 第2节 进一步工作和展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文和申请的专利

    • 相关论文文献

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