人乳头瘤病毒11型L1蛋白的突变分析及其类病毒颗粒疫苗的研制

论文摘要

流行病学和相关研究证实人乳头瘤病毒（HPV）感染与尖锐湿疣、宫颈上皮瘤样增生和宫颈癌的发生关系密切。其中,HPV6、11型是尖锐湿疣的主要致病因子,大约90%的生殖器疣与HPV6和HPV11有关。预防HPV11感染的疫苗研制具有良好的社会效益及经济效益。研究结果表明,HPV L1能独立组装成为HPV类病毒颗粒（VLP）,从而良好地再现HPV的天然中和表位,并具有较好的免疫原性,是目前预防性疫苗研究的主要目标蛋白。本研究利用原核表达系统非融合表达HPV11 L1蛋白及其突变体,研究N端序列以及关键氨基酸对HPV11 L1的表达和VLP组装效率的影响,从而获得可用于预防HPV11病毒感染的疫苗。首先,HPV11-L1蛋白N端缺失突变结果表明,N端缺失不超过16aa的突变不影响VLP的形成,但对目的蛋白的表达量有不同程度的影响,其中缺失4aa的突变体HPV11N4C-L1在大肠杆菌中的表达量较大,可用于预防性疫苗的研究。其次,分析Genebank中两株HPV11序列发现在aa364、aa453、aa501出现差异(分别为Glu364和Lys364、Ser453和Tyr453、Lys501和Arg501),实验显示两种蛋白的理化性质和VLP的组装有较大的差异。定点突变实验表明,aa453与aa501的差异并不影响蛋白的性质,但aa364对VLP的组装效率至关重要。进一步将aa364突变成为Gln、Asp、Arg、Phe、Gly和Leu的实验表明,氨基酸侧链对蛋白的表达和组装有显著的影响。HPV11 L1蛋白的结构模建结果表明,aa364位于维系L1结构的重要β-折叠上,计算机突变分析提示aa364侧链参与的氢键形成以及与周围氨基酸的碰撞可能是影响VLP组装的原因。多HPV序列比对分析显示,相当于HPV11-L1 aa364的氨基酸在其它型别序列上高度保守,均为本研究所确认的Glu。最后,利用上述本研究的突变研究,选定HPV11N4C-L1(含Glu364)为目的基因进行HPV11预防性疫苗的研制。本研究成功地建立了一套发酵、纯化和复性工艺,并获得达到新药临床试验要求的HPV11型疫苗。动物实验结果显示,该疫苗可诱导小鼠产生较高滴度的中和抗体,中和抗体与HPV6型存在明显的交叉反应。总之,本研究为HPV11的L1蛋白性质研究、VLP组装机理提供了结构信息,为HPV11疫苗的分子设计提供了参考,成功地研制出针对HPV11的预防性疫苗,并为HPV6和HPV11杂合疫苗的研制提供了依据。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要（Abstract）
• 第一章 前言
• 一、HPV简介及国内外研究状况
• 1.1 HPV 简介
• 1.2 HPV 的流行病学
• 1.3 HPV 感染机制
• 1.4 HPV 相关疾病
• 二、HPV 的形态和理化性质
• 2.1 HPV的形态结构
• 2.2 HPV 的基因组结构
• 2.3 HPV的主要抗原表位
• 三、 乳头瘤病毒感染模型
• 3.1 乳头瘤感染动物模型
• 3.2 HPV 组织培养模型
• 3.3 转基因动物模型
• 3.4 HPV 假病毒感染模型
• 四、HPV疫苗的研制
• 4.1 HPV治疗性疫苗
• 4.1.1 多肽疫苗
• 4.1.2 病毒载体疫苗
• 4.1.3 嵌合型乳头瘤病毒疫苗
• 4.1.4 基因疫苗
• 4.2 HPV预防性疫苗
• 4.2.1 类病毒（VLP）疫苗
• 4.2.2 预防性疫苗的研究现状
• 4.3 疫苗研制中不同的表达体系
• 4.3.1 真核表达系统
• 4.3.2 原核表达系统
• 五、本论文研究的目的、方法及意义
• 第二章 材料与方法
• 1. 仪器
• 2. 材料
• 2.1 菌株、细胞株、质粒和引物
• 2.2 酶和单抗
• 2.3 其他试剂
• 2.4 常用溶液及培养基的配制
• 3. 方法
• 3.1 PCR 扩增反应
• 3.2 小量质粒快速提取
• 3.3 酶切方法
• 3.4 胶回收 Kit 回收片段
• 3.5 乙醇沉淀法回收线性质粒
• 3.6 连接反应
• 3.7 E.coli 感受态细胞的制备
• 3.8 连接产物的转化
• 3.9 质粒DNA 的转化
• 3.10 酶切鉴定
• 3.11 工程菌的小量诱导表达
• 3.12 工程菌的大量诱导表达
• 3.13 高压均质机的使用
• 3.14 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.15 蛋白质免疫印迹法（western-blotting）
• 3.16 AKTA 色谱纯化
• 3.17 分子筛层析分析
• 3.18 动态光散射实验
• 3.19 重组蛋白的透射电镜观察
• 3.20 计算机辅助分析及设计
• 3.21 疫苗原液检定规程
• 3.22 小鼠免疫实验和采血
• 3.23 小鼠免疫实验和采血
• 3.24 HPV11-L1 蛋白的分子模建及点突变分析
• 第三章 结果与分析
• 第一部分 HPV11 L1 N 端的缺失突变
• 一、N 端缺失突变体的构建
• 1.1 HPV11-L1 全长基因的获得
• 1.2 HPV11-L1 N 端缺失不同数目氨基酸突变体的构建
• 二、HPV11-L1 的表达与鉴定
• 三、高表达量缺失突变体的获得
• 四、N端缺失突变体组装的VLP
• 五、第一部分的小结
• 第二部分 HPV11-L1 及其点突变多肽的性质研究
• 一、 aa364 点突变多肽的获得
• 二、 野生型及突变型L1 性质的比较
• 2.1 野生型及突变型HPV11-L1 表达水平的比较
• 2.2 野生型及突变型 HPV11-L1 VLP 组装性质的比较
• 三、 利用Insight-II分析其VLP组装差异的原因
• 3.1 aa364 同源性分析
• 3.2 HPV11-L1 三维结构模型的构建
• 3.3 氢键
• 3.4 氨基酸的空间构象及其分子间相互作用
• 四、 第二部分小结
• 第三部分 HPV11-L1 VLP 疫苗的研制
• 一、 目的蛋白HPV11N4C-L1 的高密度发酵
• 二、 HPV11N4C-L1 初级分离纯化条件的摸索
• 三、 HPV11N4C-L1 精制分离纯化条件的摸索
• 3.1 阴离子交换色谱纯化条件的摸索
• 3.2 阳离子交换色谱纯化条件的摸索
• 3.3 疏水相互作用层析条件的摸索
• 3.4 精制分离纯化阶段的中试放大
• 3.5 精制分离纯化阶段小结
• 四、 类病毒颗粒的体外组装及电镜观测
• 4.1 类病毒颗粒体外组装条件的优化
• 4.2 HPV11N4C-L1 VLP 的透射电镜观测
• 五、 HPV11-L1 VLP 原液的检定
• 5.1 检定原则与规程
• 5.2 HPV11-L1 VLP 检定结果
• 5.3 HPV11-L1 VLP 原液检定小结
• 六、 HPV11-L1 VLP 免疫动物的保护性评价
• 6.1 HPV11-L1 VLP 免疫小鼠后抗体检测
• 6.2 HPV11-L1 VLP 抗体中和滴度的检测
• 七、 第三部分的小结
• 第四章 讨论
• 第一部分 HPV11 L1 N 端缺失突变
• 一、 HPV11-L1 高表达量克隆的获得
• 1. 外源蛋白表达系统
• 2. 可溶性表达策略
• 3. 本研究采用的表达策略
• 4. N 端法则
• 5. N 端缺失对VLP 组装的影响
• 第二部分 N 端缺失及点突变对L1 蛋白性质的影响研究
• 一、蛋白质的空间构象分析
• 二、利用Insight-II分析点突变氨基酸性质
• 第三部分 HPV11-L1 VLP 疫苗的研制
• 一、 初级分离纯化阶段
• 二、 精制分离纯化阶段
• 三、 VLP 的体外组装及活性分析
• 四、 HPV11 VLP 疫苗的免疫保护评价
• 小结与展望
• 参考文献