论文摘要
T细胞的活化除了需要通过APC递呈MHC-抗原肽给抗原特异性T细胞提供第一信号外,还需要表达于免疫细胞表面一系列共刺激分子提供第二信号。如果缺少第二信号,将会导致T细胞的无反应性或免疫耐受。共刺激分子的协同加强或负性调节在机体免疫应答的整个过程中起着及其重要的调节作用。小鼠B7-H3属B7超家族新成员。迄今B7-H3的生物学特性和功能研究尚待深入并存在争议。目前的研究认为,B7-H3在介导T细胞免疫应答中存在2种截然不同的作用:协同刺激或抑制T细胞免疫应答。此外一些研究提出B7-H3分子可以作为肿瘤如肺癌,前列腺癌以及神经母细胞瘤细胞的表面标记分子具有诊断和干预靶向价值。进而鉴于B7-H3受体尚未得到最终确认,这也是B7-H3研究中存在的最大困难。本研究旨在通过建立小鼠B7-H3基因转染细胞株,研制特异性单克隆抗体和融合蛋白,从不同角度探讨B7-H3的生物学功能。本论文分为两个部分:一、小鼠B7-H3基因转染细胞株及其单克隆抗体的研制1.采用RT-PCR的方法从小鼠骨髓来源的DC中扩增出小鼠B7-H3编码区全长基因。经双酶切后插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建成重组载体pIRES2-EGFP/B7-H3。通过脂质体法将测序正确的重组载体pIRES2-EGFP/B7-H3转染293和CHO细胞,G418加压筛选并经过数次亚克隆。流式细胞术分析显示B7-H3基因同时转染的293和CHO细胞膜上能稳定高表达小鼠B7-H3分子。为研制小鼠B7-H3单克隆抗体提供了有效的免疫原。2.以转基因细胞株293/B7-H3为免疫原,免疫SD大鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫大鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,HAT选择性培养基培养杂交瘤细胞。以CHO/B7-H3为阳性筛选细胞,CHO/mock细胞作阴性对照,FCM分析筛选阳性克隆,经过亚克隆化培养,最终获得2株持续、稳定分泌大鼠抗小鼠B7-H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株（18F9和19F6）。经荧光微球法鉴定,两株单抗重链均为IgG2b,轻链为κ链。Western blot及流式细胞分析均显示,两株单抗都能与B7-H3分子特异性结合,且两株单抗识别不同的抗原表位。体外长期培养和液氮冻存后,复苏的杂交瘤细胞生长状态良好,稳定分泌抗体。研究发现小鼠B7-H3在B细胞、单核细胞和DC细胞上组成性表达,在静息和活化的T细胞、NK细胞上不表达。小鼠B7-H3蛋白表达在膀胱上皮细胞胞浆和膜上,而在其他正常组织几乎都不表达。由此表明,所研制的单克隆抗体能运用于流式荧光标记,免疫印迹及免疫组化,具有重要的应用价值。二、小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究通过重叠PCR技术将小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因拼接,按照构建B7-H3基因转染细胞的方法将重组基因转染CHO细胞,经筛选并获得CHO/mB7-H3-Fc转染细胞。该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白,经Western blot鉴定。通过CCK-8和ELISA方法检测发现该融合蛋白对T淋巴细胞的体外增殖和细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌具有明显的促进作用。在T细胞体外增殖实验中,单抗的加入可部分阻断T细胞分泌细胞因子。该融合蛋白识别T细胞上的受体,而与构建的TLT2基因转染细胞株不结合,提示B7-H3的受体可能不是TLT2分子。同时也表明所研制的单抗具有阻断功能。综上所述,本实验构建了基因转染细胞株293/B7-H3和CHO/B7-H3;研制2株特异性大鼠抗小鼠B7-H3功能性单克隆抗体和mB7-H3-Fc融合蛋白基因。该融合蛋白能够促进T细胞体外增殖及分泌IL-2,IFN-γ。T细胞体外增殖试验显示,单抗18F9对B7-H3介导的刺激T细胞分泌细胞因子具有阻断作用。研究也证实TLT2分子不是小鼠B7-H3的受体。B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用。总之,上述结果为深入研究B7-H3分子在免疫应答和肿瘤免疫中的重要作用奠定物质基础。
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