利用噬菌体展示随机环七肽库筛选HPA小肽抑制剂

论文摘要

癌症成为致命的疾病，不仅在于癌细胞的恶性增殖，更在于其转移能力。乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是参与细胞外基质及基底膜降解而帮助癌细胞在人体内肆虐的关键酶，故成为许多抑制剂作用的靶标。HPA是裂解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和细胞基底膜（basement membrane，BM）中乙酰硫酸肝素盐蛋白聚糖（heparin sulphate proteoglycan，HSPG）中乙酰硫酸肝素盐（heparin sulphate，HS）的内源葡萄糖醛酸酶的统称。80年代中期首次发现HPA与肿瘤转移的关系，但由于其性质不稳定，缺乏快速、简便的检测方法，纯化非常困难，阻碍了它的发展。近年来多家实验室独立克隆出其基因，为研究肿瘤转移开辟了一个很有潜力的领域。据文献报道，本室设计引物PCR合成出HPA小亚基基因序列，并实现了其在大肠杆菌中的高效表达。经过Histrap FF柱纯化，蛋白纯度达98％以上。采用固相筛选法，以HPA小亚基为靶蛋白，从噬菌体展示随机多肽库中筛选HPA小肽抑制剂。经5轮筛选，对HPA小亚基蛋白具有亲和力的噬菌体富集了约1000倍。从后三轮筛选的平皿上随机挑取148个单克隆噬菌体蓝斑，ELISA鉴定其亲和活性，其中90个单克隆样品呈阳性反应，阳性率达60.8％。以包被液和人表皮生长因子（EGF）为阴性对照，进一步ELISA检测第五轮筛到的阳性克隆与靶蛋白作用特异性，结果显示，这些阳性克隆只对HPA小亚基蛋白显示出高亲和活力，而对作为阴性对照的包被液和EGF几乎没有亲和作用。挑选25个呈明显阳性反应的噬菌体单克隆样品进行DNA序列分析，共获得17种环七肽，这些环肽在肿瘤靶向治疗药物设计方面有潜在的应用价值。其中环七肽P1是噬菌体展示随机环七肽库筛选获得的一致氨基酸序列，并对筛选到的环七肽P1和P8环七短肽进行化学合成。我们采用人HPA表达阴性的人乳腺癌细胞株MCF-7和人HPA表达阳性的人肝癌细胞株HepG-2建立Transwell体外侵袭实验模型，检测筛选环七肽的体外细胞活性。结果表明：MCF-7细胞的侵袭力弱，不能穿过模拟人体基底膜的Matrigel胶；而HepG-2细胞能够穿过Matrigel胶；环七肽P1能够抑制HepG-2细胞体外侵袭重组基底膜，抑制率达57.1％，而且在一定剂量范围内，HepG-2细胞体外侵袭抑制率与P1的加入剂量呈正相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 靶蛋白HPA小亚基的表达和纯化
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要培养基和溶液的配制
• 1.3 主要仪器
• 1.4 设计合成引物
• 1.5 PCR扩增目的条带
• 1.6 重组质粒的构建
• 1.7 HPA小亚基蛋白的表达
• 1.8 蛋白的纯化
• 1.9 Folin-酚试剂法测定蛋白浓度
• 2.结果与讨论
• 2.1 HPA小亚基的PCR结果
• 2.2 HPA小亚基蛋白的诱导表达、分离纯化
• 2.3 HPA小亚基蛋白的透析复性
• 2.4 结论
• 2.5 讨论
• 第二章 噬菌体展示随机肽库的筛选及初步鉴定
• 1.材料与方法
• 1.1 菌株、蛋白和抗体库
• 1.2 酶和主要生化试剂
• 1.3 主要培养基和溶液的配制
• 1.4 主要仪器
• 1.5 靶抗原蛋白的处理
• 1.6 噬菌体展示随机环七肽库的筛选
• 1.7 ELISA筛选噬菌体阳性克隆
• 1.8 阳性噬菌体克隆的DNA序列测定及同源性分析
• 2.结果与讨论
• 2.1 噬菌体展示随机环七肽库筛选回收率
• 2.2 噬菌体单克隆样品的亲和力鉴定
• 2.3 ssDNA及短肽氨基酸序列分析
• 2.4 结论
• 2.5 讨论
• 第三章 小分子多肽的合成与活性测定
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要细胞培养基及溶液配制
• 1.4 主要仪器
• 1.5 实验方法
• 2.结果与讨论
• 2.1 化学合成环七肽P1和P8的鉴定图谱
• 2.2 肿瘤细胞体外侵袭模型的建立
• 2.3 样品对HepG-2细胞体外侵袭行为的影响
• 2.4 结论
• 2.5 讨论
• 讨论
• 一、HPA小亚基蛋白的高浓度透析复性
• 二、噬菌体展示随机多肽库技术及本课题的意义
• 三、噬菌体展示随机环七肽库筛选实验方法及结果分析
• 四、体外重组基底膜试验检测筛选小肽活性
• 参考文献
• 致谢
• 附录