论文摘要
研究背景迄今为止,已经有100多种多糖被报道,其药理作用涉及免疫调节、抗肿瘤、抗损伤、抗血栓与治疗糖尿病等,90%以上的多糖具有免疫调节作用。一般认为多糖的免疫调节作用机制与体液免疫和细胞免疫有关,尤其是调节巨噬细胞（Macrophage,Mφ）的功能,许多中药多糖具有刺激巨噬细胞释放促炎症因子或者某些细胞因子的作用,推测其机制与巨噬细胞膜上的模式识别受体（Pathogen recognition receptor, PRR）结合引起细胞内某些信号通路的活化有关,甘露糖受体（Mannosereceptor,MR）即为其中之一。MR可特异性地识别以甘露糖、岩藻糖或N-乙酰葡糖胺为末端的配体并与之结合,在病原体的识别、吞噬与清除,在结核、肿瘤、感染等许多疾病发生发展过程中都发挥着重要的作用。本课题组前期研究结果表明,大黄多糖（Rheumtanguticumpolysaccharide ,RTP）在结肠炎的治疗中具有免疫调理作用,其机制与对抗结肠炎大鼠CD4+T细胞的增殖,调理Th1/Th2细胞极化的平衡有关;但其作用靶点尚不清楚。已知许多中药多糖富含甘露糖残基或N-乙酰葡糖胺残基等,且以反复串联的结构存在,如壳寡糖含有丰富的甘露糖残基,可通过结合Mφ表面的MR,活化Mφ,并进一步产生IL-1β和TNF-α参与免疫调节。而RTP含有49.07%的甘露糖,因此,我们推测RTP具有潜在的MR结合特性,其免疫调理可能与巨噬细胞MR的作用相关。本课题以异硫氰酸荧光素甘露糖牛血清白蛋白（Man-FITC-BSA）特异性地与甘露糖受体结合为模型,通过竞争性抑制实验,以不同单糖组成的RTP为研究对象,采用一级结构明确的当归多糖（AngelicasinensisDielpolysaccharide,APS）为对照,将RTP、APS分别与腹腔Mφ共同孵育后,用荧光显微镜和多功能酶标仪检测腹腔Mφ摄取Man-FITC-BSA的情况;通过ELISA方法检测RTP、APS刺激Mφ分泌TNF-α及IL-4的情况。探讨RTP、APS与腹腔MMR的结合特性及其对腹腔Mφ免疫功能的影响,以探讨中药多糖免疫调节作用的机制,为多糖类药物的作用机制研究提供新思路。实验方法1.巨噬细胞甘露糖受体表达和分布的研究:采用腹腔冲洗法获得腹腔Mφ,差速贴壁法纯化,以免疫组化法观察腹腔MMR的分布。2.大鼠腹腔巨噬细胞甘露糖受体与配体亲和力研究:将纯化的Mφ与MAN-FITC-BSA共同孵育60分钟,同时分别加入D-甘露糖、D-半乳糖、EDTA(10-4、10-3、10-2、10-1、1.0g/L),以荧光显微镜和多功能酶标仪检测MMR与配体的结合情况。3.大黄多糖和当归多糖对结肠炎大鼠MMR亲和力的比较:采用TNBS诱导大鼠实验性结肠炎模型,于造模后第六天处死大鼠,分离纯化腹腔Mφ,将纯化的Mφ分为空白组、正常组（4℃孵育）、正常组（37℃孵育）、D-甘露糖组、RTP-1、RTP-2、APS-1、APS-2、APS-3(10-4、10-3、10-2、10-1、1.0g/L)组,各组中分别加入MAN-FITC-BSA除正常组（4℃）在4℃孵育60min外,其余各组均在37℃孵育60min,采用荧光显微镜和多功能酶标仪检测正常及结肠炎时MMR活性的变化及RTP、APS与MMR亲和力的大小;观察正常组、模型组、RTP治疗组MMR亲和力的变化。4.大黄多糖和当归多糖对结肠炎大鼠巨噬细胞功能的影响:采用TNBS诱导大鼠实验性结肠炎模型,将纯化腹腔Mφ分为正常组、模型组、D-Man组（1.0g/L）、RTP-2(10-2,10-1,1.0g/L)、APS-3(10-2,10-1,1.0g/L)组、RTP-2（1.0g/L）+Man组（1.0g/L）、APS-3（1.0g/L）+Man（1.0g/L）组,孵育24小时,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中TNF-α及IL-4的水平,观察体外给予RTP和APS对正常及结肠炎时腹腔Mφ分泌细胞因子的影响。实验结果1.巨噬细胞甘露糖受体分布巨噬细胞培养2d时,可见其多数呈圆形或卵圆形,部分Mφ（26.1%±5.3%）伸展;巨噬细胞培养5d时,可见大多数Mφ（91.4%±8.7%）已经伸展,呈梭形或者多角形。免疫组织化学结果显示胞膜和胞质上存在MR阳性信号。2.大鼠腹腔巨噬细胞甘露糖受体与配体亲和力研究:（1）在4℃,Man-FITC-BSA主要与细胞膜表面的MR结合,与对照组相比荧光强度没有显著性差异（P>0.05）;在37℃时,Man-FITC-BSA主要被吞噬进入细胞,与对照组相比荧光强度呈现显著性差异（P<0.05）,且呈现明显剂量依赖性（R2 =0.9694）;（2） MR与其配体的结合呈现Ca2+依赖特点,D-甘露糖可竞争性地抑制Man-FITC-BSA与MR的作用,而D-半乳糖则没有此作用。3.不同单糖组成的RTP、APS与不同状态巨噬细胞甘露糖受体亲和力的比较:（1）RTP和APS均可显著抑制Mφ对Man-FITC-BSA的吞噬作用,其中含有甘露糖49.07%的RTP-2作用最强;其顺序为RTP-2>APS-3>RTP-1>APS-2>APS-1;（2）与正常大鼠相比（2.47±0.75百万个）,结肠炎大鼠Mφ数目显著增加（9.43±0.83百万个）、伸展速率加快,但吞噬能力降低;RTP治疗后,可抑制结肠炎大鼠Mφ数目的增加（3.02±1.12百万个）、降低伸展速率,改善其吞噬能力。4.RTP、APS对不同状态巨噬细胞功能的影响:（1）甘露糖对Mφ分泌TNF-α与IL-4的水平没有显著性影响;（2） RTP、APS均可显著促进Mφ分泌TNF-α,且呈剂量依赖性;而对IL-4的水平没有显著性影响;（3） RTP对Mφ分泌TNF-α的作用可被甘露糖完全抑制,而APS对Mφ分泌TNF-α的作用仅被Man部分阻断;（4）RTP和APS均进一步促进结肠炎大鼠Mφ分泌TNF-α的作用:正常大鼠Mφ分泌TNF-α为110.19±11.01ng/L,结肠炎大鼠MφTNF-α为198.03±23.07ng/L;给予RTP和APS后TNF-α分别为653.43±14.69ng/L和559.95±15.70 ng/L。结论1.建立起多糖与MR亲和力定性定量的检测方法,证明腹腔MMR与其配体的结合具有Ca2+依赖特性,其结合可被D-甘露糖、EDTA抑制,而不受D-半乳糖的影响。2.大鼠腹腔巨噬细胞甘露糖受体与RTP、APS各组分的亲和力不同,以RTP-2最强,其顺序为RTP-2>APS-3 >RTP-1>APS-2>APS-1,其亲合能力与多糖的单糖组成密切相关。3.结肠炎大鼠腹腔MMR的吞噬能力下降,TNF-α水平增加,体外给予RTP刺激后,能进一步促进TNF-α分泌。4.RTP诱导巨噬细胞分泌TNF-α的作用可能是通过甘露糖受体介导,而APS的作用仅部分与甘露糖受体有关。
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