嗜酸氧化亚铁硫杆菌ArsH蛋白铁还原酶活性的研究

论文摘要

抗砷基因普遍存在于细菌和真菌中,研究发现嗜酸氧化亚铁硫杆菌中存在着四种抗砷基因（arsB, arsC, arsR和arsH）,其中前三种基因的功能以及它们各自的抗砷机制都已得到阐述,然而,arsH（?）基因的生物学功能却不清楚。为了研究该基因的功能,本论文从A. ferrooxidans菌中克隆出了arsH（?）基因,并且在大肠杆菌中表达,通过一步亲和层析法纯化了来自嗜酸氧化亚铁硫杆菌的ArsH蛋白,表达的蛋白分子量为28KDa,含有FMN,是一种依赖于NADPH的黄素蛋白氧化还原酶,并且我们第一次报道了来源于嗜酸氧化亚铁硫杆菌的ArsH蛋白表现出了很高的铁还原酶活性,通过定点突变技术构建了ArsH蛋白的突变体,E104A,E104D,E104Q。通过紫外-可见扫描及活性检测证实谷氨酸104残基对于维持FMN辅因子的稳定性是必须的。ArsH蛋白可能在细菌体内对铁的代谢起着重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 微生物体内抗砷机制介绍
• 1.1.1 A.ferrooxidans抗砷基因
• 1.2 微生物体内的铁还原酶
• 1.2.1 生物体对铁的利用
• 1.2.2 细菌体内铁的转运
• 1.2.3 铁还原酶介绍
• 1.2.4 铁还原酶的分类
• 1.2.5 铁还原酶的反应机制
• 1.2.6 铁还原酶的结构
• 1.3 ARSH还原酶介绍
• 1.4 课题的研究目的与研究内容
• 1.4.1 依据和目的
• 1.4.2 论文的主要研究内容
• 1.4.3 论文课题受资助情况
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 A.ferrooxidans菌基因组抽提试剂
• 2.1.4 质粒提取试剂
• 2.1.5 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.6 胶回收试剂
• 2.1.7 不连续体系SDS-PAGE电泳
• 2.1.8 SDS-PAGE胶保存试剂及装置
• 2.1.9 蛋白亲和纯化试剂
• 2.1.10 实验仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCR扩增
• 2.2.2 目的片段扩增后的鉴定
• 2.2.3 酶切PCR产物及载体pLM1
• 2.2.4 载体和目的片段连接反应
• 2.2.5 转化
• 2.2.6 阳性克隆的筛选
• 2.2.7 蛋白质表达转化
• 2.2.8 蛋白质的条件表达
• 2.2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.10 蛋白质的纯化
• 2.3 定点突变
• 2.3.1 引物的设计
• 2.3.2 突变产物PCR扩增
• 2.3.3 阳性克隆的筛选
• 2.3.4 突变蛋白质的表达及纯化
• 2.4 测试分析方法
• 2.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.4.2 紫外分光光度计（UV Scanning）
• 2.4.3 分子结构模型图的模拟（Molecular structure modeling）
• 第三章 ARSH蛋白及其突变体的表达、纯化及活性测定
• 3.1 ARSH蛋白基因的克隆
• 3.1.1 ArsH蛋白基因的克隆
• 3.1.2 阳性克隆的筛选
• 3.2 ARSH蛋白的表达
• 3.2.1 ArsH蛋白表达条件的确定
• 3.2.2 ArsH蛋白大规模的表达
• 3.2.3 SDS-PAGE分析ArsH蛋白
• 3.2.4 UV/Vis分析ArsH蛋白
• 3.3 ARSH蛋白性质的鉴定
• 3.3.1 最适pH值和温度的测定
• 3.3.2 ArsH蛋白活性的测定
• 3.3.4 Glu104在ArsH催化过程中的作用
• 3.3.5 分子模拟ArsH蛋白
• 3.4 本章小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间主要的研究成果