HDAC抑制剂抗肿瘤效应靶基因的研究

论文摘要

目的通过建立一种全新的、基于基因功能的筛选手段——SMART（Suppression ofMortality by Antisense Rescue Technique）技术，寻找抵抗HDAC抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的效应基因并初步探讨其作用机制。方法250 nmol／LTSA诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡，并收集处于凋亡不同时段的细胞提取mRNA，构建反义cDNA文库。文库DNA随机转入HeLa细胞中，筛选出阳性转染细胞克隆，存活克隆经扩增后提取Hirt DNA，转化感受态细菌并测序。经生物信息学分析后选择感兴趣的基因进行功能验证，并进一步探讨其作用机制。结果成功构建反义cDNA文库，片段插入率大于90％，平均长度约为1．5kb，库容约为2×105；运用NCBI blast比对获得76个EST片段；再次重复筛选验证，选定LIV-1基因进行进一步研究。实验显示，HDAC抑制剂可以选择性诱导肿瘤细胞中LIV-1基因的表达，平板克隆形成实验、MTT实验和FACS检测凋亡实验显示下调LIV-1表达可以抵抗HDAC抑制剂诱导的细胞凋亡，这一效应可能与封闭LIV-1后肿瘤细胞内锌离子稳态被破坏有关。结论SMART技术作为一种基于基因功能的筛选手段，可以高通量、特异性的获得在HDAC抑制剂诱发细胞凋亡过程中的效应基因；基因LIV-1可能是HDAC抑制剂抗肿瘤效应的靶基因，下调LIV-1表达可抵抗HDAC抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡，这一效应可能与封闭LIV-1后肿瘤细胞内锌离子稳态被破坏有关。背景和目的研究表明，在HDAC抑制剂的作用下，细胞中占总数17％的基因转录水平会发生变化。如此广泛的作用靶点使得HDAC抑制剂在启动某些治疗性反应的同时也启动了某些意想不到的保护性程序，后者严重影响到HDAC抑制剂的最佳临床疗效。目前临床上由于HDAC抑制剂单药用药治疗效能较低，仅被作为辅助用药，与一些传统的一线化疗药联用，达到增强疗效的目的。因此，揭示其低效能背后暗藏的分子机制对推动该类治疗性药物的临床应用具有重要意义。方法和结果通过cDNA芯片分析，我们发现HDAC抑制剂作用后细胞内大量粘附分子表达上调，其中以粘附分子CDl46的上调最为显著。以CD146为代表，通过Realtime PCR、Western blot和免疫组化等方法证实了，在HDAC抑制剂的作用下，多种肿瘤细胞系、原代肿瘤细胞和动物体内CD146被明显上调。将CDl46的单克隆抗体与HDAC抑制剂联用显著增强了HDAC抑制剂的促进凋亡和抑制血管生成的作用，从而抑制肿瘤恶性生长与转移。其作用机制可能与下调PI3K/AKT／mTOR通路的活性有关。结论HDAC抑制剂单药用药治疗效能较低的原因可能是由肿瘤细胞中粘附分子表达增高引起，将粘附分子的单抗与HDAC抑制剂联用可以增强HDAC抑制剂抗肿瘤的生物学效应。这些临床前期研究提示抗粘附剂的使用将对提高HDAC抑制剂效能有很大帮助，为今后的临床治疗提供了一种新的思路和策略。

论文目录

第一部分 SMART技术筛选HDAC抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡靶基因的研究

前言

中文摘要

英文摘要

材料方法

结果

讨论

参考文献

第二部分粘附分子CD146在HDAC抑制剂抗肿瘤效应中的保护作用及机制研究