利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株

论文摘要

本文从南阳酒精酵母1308（Saccharomyces cerevisiae）的二倍体出发,利用随机孢子分析得到了单倍体并进行了发酵性能试验,筛选到了一株发酵性能较好的单倍体D-12。对亲本菌株D-12和嗜鞣管囊酵母（Pachusolen tannophilus）P-01的原生质体形成和再生条件进行了试验,其最佳条件分别为:培养9h的菌体,采用0.1%β-巯基乙醇预处理30min,4mg/mL的蜗牛酶和4mg/mL的纤维素酶的混和酶液酶解1.5h,原生质体的形成率和再生率分别为93.6%和15.9%:培养21h的菌体,采用0.1%β-巯基乙醇预处理30min,4mg/mL的蜗牛酶和4mg/mL的纤维素酶的混和酶液酶解1.5h,原生质体的形成率和再生率分别为97.7%和9.9%。采用高温灭活的方法对亲株D-12的原生质体进行彻底灭活,条件为:70℃水浴处理35min。采用紫外灭活的方法对亲株P-01的原生质体进行彻底灭活,条件为:15w紫外灯下距离30cm垂直照射60s。用PEG作促融剂诱导灭活的双亲原生质体进行融合,经TTC平板初筛、发酵复筛和同工酶鉴定,获得一株能够进行全糖发酵（总糖浓度为6%）的性能优良的融合子F10。其酒精度达到1.3ml/100ml（v/v）,比亲株P-01（0.95ml/100ml）提高了36.8%。最后,我们研究了融合子F10在玉米秸秆水解液中的发酵性能。F10发酵玉米秸秆水解液结束时酒精度达到1.1ml/100ml（v/v）,远远高于亲株P-01（0.6ml/100ml）和D-12（0.3ml/100ml）。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1 能源紧张与生物质能源
• 2 我国能源现状与开发纤维燃料乙醇的潜力
• 3 纤维燃料乙醇发展概况
• 4 对全糖发酵菌种的研究
• 5 原生质体融合技术概述
• 5.1 原生质体融合的概念
• 5.2 细胞融合的起源和发展
• 5.3 微生物原生质体融合技术
• 5.3.1 微生物原生质体融合技术的概念
• 5.3.2 微生物原生质体融合技术在育种上的应用
• 5.3.3 微生物原生质体融合技术的优缺点
• 6 本课题的目的和意义
• 7 本文所用菌株的性能
• 7.1 嗜鞣管囊酵母P-01（Pachusolen tannophilus）的性能
• 7.2 南阳酒精酵母1308（S.cerevisiae）的性能
• 8 本课题研究内容及技术路线
• 第二章 原生质体的制备和再生
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂
• 1.4 酶制剂
• 1.5 主要仪器设备
• 1.6 实验方法
• 1.6.1 南阳酒精酵母1308单倍体的制备
• 1.6.2 南阳酒精酵母1308单倍体的筛选
• 1.6.3 单倍体D-12原生质体的制备和再生
• 1.6.4 P-01原生质体的制备和再生
• 1.6.5 原生质体形成率和再生率的计算
• 1.7 分析方法
• 1.7.1 总糖含量测定
• 1.7.2 木糖含量测定
• 1.7.3 酒精度测定
• 1.7.4 葡萄糖含量测定
• 2 结果与分析
• 2.1 南阳酒精酵母1308单倍体的制备
• 2.2 南阳酒精酵母1308单倍体发酵性能的试验
• 2.3 不同预处理剂对D-12原生质体形成和再生的影响
• 2.4 不同酶液组合对D-12原生质体形成和再生的影响
• 2.5 不同酶解时间对D-12原生质体形成和再生的影响
• 2.6 P-01原生质体的制备和再生
• 3 本章小节
• 第三章 双亲原生质体的灭活、融合及融合子的检出
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂与溶液
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 嗜鞣管囊酵母P-01原生质体的紫外灭活
• 1.5.2 D-12原生质体的高温灭活
• 1.5.3 双亲灭活原生质体的融合
• 1.5.4 融合子的初筛
• 1.5.5 融合子的复筛
• 1.5.6 融合子的鉴定
• 1.5.7 融合子的遗传稳定性试验
• 2 结果与分析
• 2.1 P-01原生质体紫外灭活条件的研究
• 2.2 D-12原生质体高温灭活条件的研究
• 2.3 TTC平板初筛结果
• 2.4 采用全糖发酵对融合子的复筛
• 2.5 融合子的酯酶同工酶电泳图谱
• 2.6 融合子的遗传稳定性试验
• 3 本章小节
• 第四章 融合子F10发酵秸秆水解液试验研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种和原料
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 玉米秸秆糖化液的制备
• 1.5.2 F10发酵玉米秸秆水解液试验
• 2 结果与分析
• 2.1 发酵过程中糖消耗分析
• 2.2 发酵过程中酒精度的变化
• 3 本章小节
• 第五章 结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 参考文献
• Abstract