棉铃虫对转Bt基因棉抗性的分子检测方法研究

论文摘要

棉铃虫Helicoverpa armigera(H(u∣¨U)bner)是广泛分布于世界各大洲的重要农业害虫。上个世纪以来,棉铃虫对大多数的化学杀虫剂产生抗药性,使对其的防治愈加困难。Bt杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins,ICPs)因其具有对靶标昆虫的高度特异性和对人畜无害的安全性的优点,被人们应用于防治棉铃虫。但随着转Bt基因棉种植面积的不断扩大,转入的Bt毒蛋白在棉花的整个生长期内持续表达,使得棉铃虫在生长期间不断地受到转Bt基因棉的高选择压,存在着棉铃虫对转Bt基因棉产生抗性的风险。一旦棉铃虫对转Bt基因棉产生大范围或较大的抗性,那将是我国甚至世界的棉花生产毁灭性打击,因此,对棉铃虫对转Bt基因棉抗性的检测监测势在必行。检测田间棉铃虫对转Bt基因棉的抗性,可以对棉铃虫的田间种群的抗性发展作评估,对棉铃虫对Bt棉的抗性提供早期预警。棉铃虫对Bt棉的抗性基因频率的检测结果,将能直接指导棉花的种植。本研究的分子检测技术也可以为其他农业害虫的田间检测提供借鉴。传统的生物测定方法早已应用于监测害虫对Bt基因棉的抗性,但是传统的生物测定方法有其制约性,如:无法区分杂合子(sr)和敏感纯合子(ss)、采样量大、需饲养昆虫、费时、费力、灵敏度不够高等。以DNA为基础的抗性检测方法能直接检测到杂合子的抗性等位基因(r),可明显提高抗性检测的灵敏度和效率。基于DNA分子技术的检测技术与传统的需要活虫的生物测定技术相比,拥有很多的优点,如:(1)不管是显性特征还是隐性特征,DNA分子检测技术都可以区分个体是杂合子(sr)还是敏感纯合子(ss);(2)DNA分子检测技术直接检测基因的不同,而不是依赖于观察表型的不同;(3)DNA分子检测技术在害虫的各个生长发育期都可以应用,甚至是死虫也可以应用;(4)在抗性纯合子数量稀少的情况下,DNA分子检测技术比传统的检测方法更有效、更灵敏。本论文通过对比分析了对转Bt基因棉抗性的棉铃虫钙粘素mRNA序列(AY714874)和敏感mRNA序列(AY351904),以及抗性棉铃虫钙粘素基因组DNA序列(AY714875)和敏感棉铃虫钙粘素基因组DNA序列(AY714876)。选择保守的外显子序列区域,设计了5套引物用于检测抗性基因,并进行筛选。利用设计并筛选过的2套引物检测田间棉铃虫因钙粘素突变引起的对转Bt基因棉的抗性。结果表明,所设计的五套引物均能百分百地在棉铃虫室内品系DNA中扩增出清晰的特异性目标条带,但第二套引物的抗性条带和敏感条带,不易区分,不适合做田间检测;第一套引物和第四套引物虽然在棉铃虫室内品系DNA中的扩出率为100%,但是在扩增田间棉铃虫DNA时,有一部分田间棉铃虫DNA能扩增出条带,不适合做田间检测;第三套引物和第五套引物在棉铃虫室内品系DNA中以及田间棉铃虫DNA中的扩出率均为100%,适合于做田间检测。应用第三套引物和第五套引物对采集自河北邱县转Bt基因棉区的1585头棉铃虫进行检测,未发现与室内棉铃虫抗性一致的因钙粘素突变引起的对转Bt基因棉产生抗性的突变类型。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 名词缩写
• 第一章 文献综述
• 1.1 棉铃虫及其抗药性
• 1.1.1 棉铃虫简介
• 1.1.2 棉铃虫的抗药性
• 1.1.2.1 棉铃虫对有机氯杀虫剂的抗性
• 1.1.2.2 棉铃虫对氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性
• 1.1.2.3 棉铃虫对有机磷类杀虫剂的抗性
• 1.1.2.4 棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性
• 1.2 苏云金芽孢杆菌
• 1.2.1 苏云金芽孢杆菌简介
• 1.2.2 苏云金芽孢杆菌的杀虫成分
• 1.2.3 δ-内毒素的杀虫机理
• 1.2.4 δ-内毒素的受体
• 1.2.4.1 氨肽酶
• 1.2.4.2 钙粘素
• 1.2.4.3 其他受体
• 1.3 转Bt基因作物的研究与应用
• 1.3.1 转Bt基因作物的研究
• 1.3.2 转Bt基因作物的应用
• 1.3.3 转Bt基因作物的效益与风险
• 1.3.4 害虫对转Bt基因作物的抗性研究
• 1.3.4.1 害虫室内品系对转Bt基因作物的抗性研究
• 1.3.4.2 田间害虫对转Bt基因作物的抗性研究
• 1.3.4.3 害虫对转Bt基因作物的抗性机理
• 1.3.4.3.1 氨肽酶突变与抗性的关系
• 1.3.4.3.2 钙粘素突变与抗性的关系
• 1.3.4.3.3 其他抗性机制
• 1.4 害虫对转Bt基因作物抗性的检测方法
• 1.4.1 传统的生物测定方法
• 1.4.1.1 剂量反应曲线法
• 1.4.1.2 区分剂量法
• 1代单雌系筛选法'>1.4.1.3 F₁代单雌系筛选法
• 2代筛选法'>1.4.1.4 F₂代筛选法
• 1.4.2 分子检测方法
• 1.5 本研究的立题依据与研究目的
• 第二章 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试室内棉铃虫品系
• 2.1.2 田间棉铃虫的采集
• 2.1.3 供试棉花品种
• 2.1.4 供试试剂
• 2.1.5 供试仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 棉铃虫DNA的提取
• 2.2.2 钙粘素基因序列分析
• 2.2.3 引物设计与筛选
• 2.2.4 田间棉铃虫对转Bt基因棉抗性检测
• 第三章 结果和分析
• 3.1 棉铃虫钙粘素基因序列分析
• 3.2 DNA质量分析
• 3.3 引物设计与筛选
• 3.4 田间棉铃虫对转Bt基因棉抗性检测
• 第四章 讨论
• 4.1 高剂量/庇护所策略
• 4.2 棉铃虫田间种群对Bt的抗性
• 4.2.1 生物测定
• 4.2.2 分子检测
• 全文主要结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文情况