Bmi1基因在肺腺癌干细胞样细胞自我更新、增殖中作用的在体研究

论文摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）是威胁人类健康的常见恶性肿瘤,其发病率和死亡率稳居各类癌症之首。肿瘤干细胞理论认为,肿瘤组织具有异质性,其中存在少量具有干细胞特性的细胞,能够无限的自我更新,产生与上一代完全相同的子代细胞,并且具有多种分化潜能和高度增殖能力,产生不同表型的肿瘤细胞。这些细胞在肿瘤形成、发展、转移和复发中具有重要作用。近年来,大量研究表明,除了白血病以外,乳腺癌、肾癌、脑胶质瘤、肺癌等也有肿瘤干细胞存在。正常小鼠肺组织中有一群具有干细胞特征的细胞,约占细胞总数的0.4%,被称为支气管肺泡干细胞（bronchoalveolar stem cells,BASCs）,其表面标记是Sca-1+/CD34+。还有研究发现,人肺癌组织中部分具有CD133+表型的细胞,具有自我更新和在免疫缺陷小鼠体内成瘤的能力,能在含EGF和bFGF的无血清培养基内无限增殖,注射1×104个CD133+细胞能在免疫损伤小鼠形成与原发肿瘤表型一致的移植瘤。肺癌干细胞的发现,给非小细胞肺癌的肿瘤形成和化疗抵抗等机制的进一步研究,以及改善肺癌患者的生存率方面,带来了新的希望。在目前的研究中,主要有三种富集肿瘤干细胞的方法,主要从肿瘤干细胞生物学功能特点和其表面特异标志物两大方面来进行鉴定和筛选,包括：（1）利用流式细胞仪或免疫磁珠分选表面标志物阳性细胞,CD133和CD44可用来分离实体瘤中的肿瘤干细胞,但目前还没有发现哪一种标志物特异地在肿瘤干细胞中表达；（2）利用流式细胞仪分选“侧群细胞”（SP细胞）,分选SP细胞从肿瘤干细胞的特性入手,但Hoechst33342染料作为一种细胞DNA合成的抑制剂,分选对细胞不可避免的毒性作用限制了它的进一步应用。（3）利用肿瘤干细胞的克隆能力,无血清悬浮培养获得的“细胞球”富集肿瘤干细胞。肿瘤组织中干细胞含量极低,利用侧群细胞分选或者悬浮培养获得的细胞数量有限,难以得到满足进行后续实验要求数量的细胞。目前认为肺癌干细胞的耐药性与干细胞高表达ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporters, ABC transporters）有关,ABCG2是这当中最重要的药泵蛋白,研究多种组织来源的SP细胞,发现都有ABCG2的高表达,而且通过转基因技术发现增加ABCG2的表达可以使该细胞呈SP表型。因此ABCG2被认为是肿瘤干细胞的标志之一。利用肺癌干细胞的耐药性,本实验通过建立肺癌细胞系A549小鼠荷瘤模型,同时给予小鼠低剂量紫杉醇化疗负荷,在体富集肺癌干细胞。利用富集的肺癌干细胞,进一步研究肺癌干细胞自我更新和增殖机制。Bmil属于多梳基因家族（polycomb of genes, PcG）成员,是与细胞周期和增殖相关的重要转录抑制子。抑癌基因INK4a/ARF同时编码2个蛋白p16INK4a和p14ARF,这2个蛋白均为细胞周期调控因子,分别通过cyclinD-CDK4-Rb-E2F和MDM2-p53通路调控细胞周期,原癌基因Bmil是INK4a/ARF上游调节因子。许多研究表明,在包括非小细胞肺癌在内的多种上皮细胞源性恶性肿瘤中,存在Bmil的高表达,并且其表达量与肺癌病人的预后存在明显的负相关。近来有研究表明Bmil在多种干细胞增殖和自我更新中也有重要作用,特别是在肿瘤干细胞内存在表达增多的现象。但是Bmil是否在维持肺癌干细胞的功能中也有重要作用,目前尚未见研究报道。本实验通过在体瘤内注射慢病毒介导的Bmil-shRNA,利用RNA干扰技术下调非小细胞肺癌移植瘤内肺癌干细胞的Bmil的表达,发现伴随着Bmil的表达下降,肺癌干细胞的体外更新能力,以及在免疫缺陷小鼠体内的成瘤能力都明显下降。同时还检测了Bmil的下游调控基因之一p16INK4A的表达,发现随着Bmil的降低,肺癌干细胞内的p16INK4a表达上调。揭示了Bmil在肺癌干细胞自我更新、增殖过程中的重要作用,P16INK4a可能是Bmil发挥这些作用的靶基因之一,这为进一步研究肺癌干细胞更新、增殖的分子机制奠定了基础。目的：建立A549细胞在NOD/SCID小鼠皮下移植瘤,给予化疗负荷在瘤内富集肺腺癌干细胞,通过瘤内注射慢病毒介导的Bmil-shRNA,采用RNA干扰技术下调肺腺癌干细胞内Bmil的表达,观察Bmil在肺癌干细胞自我更新、增殖中的作用。方法：1.肺癌干细胞的富集。将A549细胞注射到NOD/SCID小鼠皮下,建立荷瘤小鼠模型。通过给予小鼠腹腔注射低剂量紫杉醇以及瘤块细胞在体传代,获得第三代移植瘤细胞A549-3rd。流式细胞仪检测A549-3rd细胞中CD133+细胞比例,real-time RT-PCR和Western blotting技术检测A549-3rd细胞中Bmil及ABCG2表达水平。2.RNA干扰抑制肺癌干细胞内Bmil的表达。包含人Bmil-shRNA及阴性对照NC-shRNA的慢病毒表达载体由上海吉凯基因化学技术公司设计合成并鉴定,该载体表达绿色荧光蛋白GFP。荷瘤小鼠随机分成3组,分别给予瘤内注射vsh-Bmil, vsh-NC或PBS。活体荧光显微镜观察移植瘤内GFP表达,确定转染效率。real-time PCR和Western blotting检测瘤体内Bmil、p16INK4a的表达水平。3.自我更新及体内成瘤能力检测。有限稀释法及无血清悬浮培养,测定A549细胞,A549-3rd细胞,A549-4th细胞,A549-4th-Bmil细胞及A549-4th-NC细胞的“干细胞球”形成率,比较各组细胞自我更新能力。采用NOD/SCID小鼠皮下注射的方法比较各组细胞体内成瘤的能力。结果：1.干细胞富集效果分析。在无血清培养基内悬浮培养7天后,仅有（1.2%±0.4%）的A549细胞形成“干细胞球”,而（15.6%±1.5%）的A549-3rd细胞形成“干细胞球”,成球能力提高了12倍（P=0.01）。由A549-3rd细胞形成的细胞球经过8-10次传代后在无血清培养基内仍可形成“干细胞球”,而由A549细胞形成的细胞球经过2-3次传代后不能再形成新的“干细胞球”。将2×105个A549细胞和A549-3rd细胞分别注射到6只NOD/SCID小鼠皮下,A549细胞在其中1只小鼠皮下成瘤,而2×105个A549-3rd细胞可在其中5只小鼠皮下成瘤。流式细胞仪检测A549-3rd细胞内CD133+细胞的比例约为69.0%,相对于A549细胞的2.3%,明显增高。A549-3rd较A549细胞内的Bmil和ABCG2的表达量明显增加,具有显著统计学差异（P=0.02）。2.RNA干扰抑制肺癌干细胞内Bmil表达及其调控基因的表达变化。瘤内注射慢病毒载体共2次,第2次后72小时,活体荧光显微镜下观察到GFP在瘤体内的表达。通过测定,注射vsh-Bmil后瘤体内得到的A549-4th-Bmil细胞内较注射vsh-NC或PBS瘤体内的A549-4th-NC细胞或A549-4th细胞内Bmil的表达明显下降（P=0.02）,而p16INK4a的表达升高,具有显著统计学差异（P=0.04）。3.自我更新及体内成瘤能力变化。在无血清培养基内培养7天后,（0.9%±0.2%）的A549-4th-Bmil细胞,（13.9%±1.1%）的A549-4th-NC细胞和（14.7%±1.3%）的A549-4th细胞形成细胞球。A549-4th-Bmil细胞的成球能力较其他两组下降了14倍（P=0.01）。将2×105个三组细胞分别皮下注射到6只NOD/SCID小鼠皮下,A549-4th-NC细胞在5只小鼠皮下成瘤,A549-4th细胞在6只小鼠皮下成瘤,而A549-4th-Bmil细胞仅在2只小鼠皮下成瘤,成瘤能力显著下降。结论：1.通过给予在体化疗负荷得到的A549-3rd细胞,自我更新能力和成瘤能力较A549细胞明显提高,CD133+的细胞比例增高,ABCG2表达量增加,说明通过一定时间的低剂量化疗,第三代细胞A549-3rd内富集了大量具有自我更新、增殖能力的肺腺癌干细胞。2.利用RNA干扰技术,使得Bmil细胞内的Bmil表达受到明显抑制。3.由于Bmil的表达下降,p16INK4a表达增高,肺腺癌干细胞的“干细胞球”形成能力、体内成瘤能力明显下降,说明Bmil在肺腺癌干细胞的自我更新、增殖中起到了重要的作用,并且其调控机制中可能包括了对p16INK4a基因的抑制作用。

论文目录

• 英文缩略词
• 英文摘要
• 中文摘要
• 前言
• 第一部分 肺腺癌干细胞的富集、验证及相关基因表达的检测
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 RNA干扰抑制肺腺癌干细胞中Bmil表达对肺腺癌干细胞自我更新、增殖的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 Bmil在肿瘤干细胞中作用的研究进展
• 参考文献
• 在读硕士期间发表论文