人c-Src全长基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究

论文摘要

非受体酪氨酸蛋白激酶Src是最早发现的原癌基因表达蛋白之一。其以两种形式存在:病毒原癌基因表达蛋白v-Src和细胞原癌基因表达蛋白c-Src,两者在进化上具有高度同源性。真核细胞中c-src基因普遍存在,调节细胞的正常生长、增殖、分化、运动和凋亡等生理功能,c-Src蛋白在细胞信号转导过程中扮演重要角色。同时,c-Src蛋白的过量表达或激酶活性异常,与许多肿瘤的生成、入侵及转移密切相关,是一种公认的癌蛋白。 目前,国内外的研究主要侧重于c-Src与疾病相关的定位定性及调控细胞功能的分子机制等方面;而在应用上,人们已经预测c-Src蛋白激酶将成为研究疾病发生机理和筛选治疗药物的重要靶蛋白。因此,运用基因工程技术快速简便地克隆表达大量高活性的c-Src蛋白,用于激酶固定化筛选肿瘤抑制剂,将具有广阔的应用前景。 本文通过构建特异性c-src的原核表达重组质粒,转化大肠杆菌克隆表达得到完整的人源c-Src蛋白。首先,运用PCR技术,分别从人肺腺癌细胞总mRNA以及获赠的pcDNA3.1/Hygro质粒中,扩增出全长的人c-src基因。经测序鉴定该序列完全正确。然后,以克隆质粒pUCm-T为中介酶切连接,将c-src基因重组到pET-28a（+）、pET-22b（+）和pPROEX HTc等备选的表达载体,转化大肠杆菌中筛选阳性重组子,并用IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳检测,发现pPROEXHTc/c-src为高效的表达重组质粒,而在pET系列的重组质粒中c-src基因得不到明显表达。工程菌通过正交实验优化的表达条件是:30℃、0.1mM IPTG、5h,然后大量表达得到（His）6/c-Src融合蛋白,在全菌蛋白表达含量中可以占20%以上。最后用（His）6-Tag特异性亲和的Ni2+-NTA层析柱分离纯化,得到的高纯度c-Src融合蛋白,与经变性透析处理的包涵体蛋白分别测定酪氨酸蛋白磷酸化活性。结果证明,表达的c-Src融合蚩白具有一定的激酶活性,短小的（His）6-Tag并不影响其结构和功能。这是国内首次在大肠杆菌原核表达体系中克隆表达得到完整的人c-Src蛋白激酶,为后期的进一步研究以及抗癌药物筛选奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文综述部分 c-Src蛋白的结构、功能及其研究应用进展
• 前言
• 1 c-src因及其蛋白的发现
• 2 c-Src蛋白组成及结构
• 2.1 一级结构
• 2.2 二级结构
• 2.2.1 二级结构详细分析
• 2.2.2 二级结构域组成
• 2.3 空间结构
• 3 c-Src蛋白的活性调节机制
• 3.1 c-src基因的转录调控
• 3.2 c-Src蛋白翻译后调控
• 4 c-Src的细胞功能
• 4.1 c-Src蛋白和信号转导通路
• 4.2 c-Src蛋白和细胞行为调控
• 4.2.1 细胞迁移
• 4.2.2 细胞增殖
• 4.2.3 细胞存活
• 4.2.4 其它
• 5 c-Src与人类疾病相关
• 5.1 Src蛋白与肿瘤
• 5.1.1 肿瘤的发生
• 5.1.2 肿瘤的发展
• 5.1.3 骨转移
• 5.2 心脑血管疾病
• 6 c-Src应用前景展望
• 参考文献
• 论文实验部分 人c-Src全长基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究
• 前言
• 1 实验材料和仪器
• 1.1 细胞及菌种
• 1.2 质粒
• 1.3 酶
• 1.4 分子量标准
• 1.5 各种试剂盒
• 1.6 缓冲液及其他溶液
• 1.7 培养基
• 1.8 其它主要试剂和商品来源
• 1.9 主要仪器设备
• 2 实验方法与步骤
• 2.1 PCR扩增
• 2.2 组织细胞总 RNA提取（Trizol法）
• 2.3 质粒 DNA抽提
• 2.4 酶切与 DNA回收
• 2.5 连接重组
• 2.6 大肠杆菌转化及筛选
• 2.7 蛋白质的表达与鉴定
• 2.8 蛋白纯化
• 2.9 活性测定
• 3 结果与分析
• 3.1 hc-src基因的获得
• 3.1.1 从获赠c-src/ pcDNA质粒来源
• 3.1.2 从人肺腺癌细胞来源
• 3.2 克隆重组构建
• 3.2.1 与 T载体的克隆重组
• 3.2.2 阳性克隆重组子的序列测定
• 3.3 表达重组构建
• 3.3.1 构建pET表达重组
• RoEX表达重组'>3.3.2 构建pP_RoEX表达重组
• 3.4 蛋白表达
• 3.4.1 确定工程菌
• 3.4.2 优化表达条件
• 3.5 蛋白纯化
• 3.6 激酶活性测定
• 4 讨论
• 4.1 hc-Src基因的获得
• 4.2 表达重组的构建
• 4.3 真核基因在大肠杆菌中的表达
• 5 结论与展望
• 参考文献
• 附录一 pUCm-T质粒图谱
• 附录二 pET-28a（+）质粒图谱
• 附录三 pET-22b（+）质粒图谱
• ROEX HTC质粒图谱'>附录四 pP_ROEX HTC质粒图谱
• 致谢