论文摘要
恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的重大疾病。在多种致癌因素共同作用下,多种恶性肿瘤发病率不断升高,给社会公共医疗系统带来巨大的压力。迄今为止,恶性肿瘤发病机制及疗效不佳的原因仍然不清。大多数肿瘤均为单克隆起源,但恶性肿瘤的组成成分存在极大的异质性,异质性的肿瘤细胞对肿瘤治疗反应差异极大。“克隆演进学说”认为,肿瘤发生和演进过程中不断发生的遗传学和表观遗传学改变在不同肿瘤细胞随机累积导致肿瘤细胞的异质性,这种异质性在治疗上的意义及靶向策略有待研究。近年肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs）的研究丰富了现有肿瘤治疗理论。CSCs研究表明,肿瘤细胞群体中仅有一小部分肿瘤细胞具有成瘤能力,这些细胞是肿瘤实质中分化程度最低的细胞亚群,具有自我更新和多向分化潜能等生物学特性。由于CSCs具有始动和重建肿瘤的能力,因而又被称为肿瘤起始细胞（tumor initiating cells, TICs）。目前认为CSCs多向分化是肿瘤细胞异质性群体出现分子表型和生物学特性差异的原因。研究者使用组织干细胞分子标记物,从一系列实体肿瘤中分离鉴定出CSCs,脑肿瘤CSCs和乳腺癌CSCs分别是研究最为深入的两种CSCs。CSCs研究不但使人们重新认识恶性肿瘤的发生和演进机制,而且具有重大的临床治疗意义。研究表明, CSCs对化疗药物和放疗呈现出抵抗特性,侵袭性/转移性CSCs可能是外科手术无法完全根除肿瘤细胞的原因。CSCs的这些生存优势使其在恶性肿瘤治疗抵抗和复发中可能发挥重要作用。因此推测CSCs可能是恶性肿瘤治疗的关键细胞,探索CSCs特异性治疗靶点和筛选CSCs靶向性药物对于改善恶性肿瘤疗效具有重要意义。有鉴于此,本研究第一部分建立乳腺癌CSCs和脑肿瘤CSCs的研究模型,第二部分检测了乳腺癌CSCs在体外和体内对NK细胞毒性效应的敏感性,探讨增加NK细胞对乳腺癌CSCs杀伤效率的干预靶点,第三部分检测了课题组自主合成的胶质瘤诱导分化化合物诺帝（Nordy）对脑肿瘤CSCs的诱导分化效应以及其作用机制,研究内容和主要结果结论如下:一、成功分离和鉴定胶质瘤CSCs和乳腺癌CSCs:1.流式分选MCF-7 CD44+CD24-和原代乳腺癌细胞ALDHhigh乳腺癌CSCs:①CD44+CD24-和ALDHhigh细胞分别比non-CD44+CD24-和ALDHlow具有更强的连续成球能力;②CD44+CD24-细胞克隆形成率高于non-CD44+CD24-细胞;③CD44+CD24-细胞高表达干细胞转录因子Nanog、Oct4和Sox2,但低表达乳腺上皮分化标志物Muc1、CK-18和肌上皮分化标志物CK-14、α-SMA;④CD44+CD24-细胞血清诱导培养可以分化为腺上皮和肌上皮分化标志物阳性细胞;⑤5×103个CD44+CD24-细胞的NOD/SCID小鼠成瘤能力强于1×106个non-CD44+CD24-细胞;⑥CD44+CD24-细胞移植瘤复制了Luminal型乳腺癌的分化表型。说明CD44+CD24-和ALDHhigh细胞具有乳腺癌CSCs的生物学特点。2.条件培养基分离培养胶质瘤CSCs:①利用条件培养基从原代胶质瘤、胶质瘤移植瘤和细胞株中培养成球生长的胶质瘤细胞,胶质瘤细胞球高表达胶质瘤CSCs标志物和干细胞相关转录因子,具有神经上皮细胞分化能力（星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元）;②1×104胶质瘤细胞球细胞具有成瘤能力,形成的移植瘤能够重现亲代胶质瘤的表型,移植瘤在裸鼠体内能够反复传代。说明条件培养基中成球生长的胶质瘤细胞球具有胶质瘤CSCs的生物学特点。二、发现乳腺癌CSCs具有逃逸NK细胞杀伤效应的生物学特性,MICA和MICB表达下调是其重要原因:1.乳腺癌CSCs比分化型乳腺癌细胞能够更好地逃逸NK细胞杀伤效应:①NOD/SCID小鼠内源性NK细胞或者外源性输入NK92细胞对乳腺癌CSCs(CD44+CD24-和ALDHhigh)的清除效率低于分化型乳腺癌细胞（non-CD44+CD24-和ALDHlow）;②NK细胞对乳腺癌CSCs的杀伤效率低于分化型乳腺癌细胞;③NK细胞与乳腺癌CSCs和分化型乳腺癌细胞的粘附率差异不显著;④乳腺癌CSCs与NK细胞共培养刺激其分泌的INF-γ少于分化型乳腺癌细胞;⑤乳腺癌CSCs刺激NK细胞表达CD107a的阳性比例低于分化型乳腺癌细胞,而乳腺癌CSCs激活NK细胞使其分泌颗粒酶B的能力低于分化型乳腺癌细胞。⑥NK92细胞反复杀伤MCF-7和原代乳腺癌细胞BC2后CD44+CD24-、ALDHhigh和p-nanog/GFP+乳腺癌CSCs比例升高;⑦NK92细胞反复杀伤MCF-7和原代乳腺癌细胞后存活细胞成球能力增加。2. MICA/B是乳腺癌CSCs低表达的NK细胞激活性配体,其低表达导致乳腺癌CSCs逃逸NK细胞杀伤:①乳腺癌CSCs与分化型乳腺癌细胞均高表达NK细胞抑制性配体HLA-ABC分子,但表达无显著差异;②两类细胞均不同程度的表达NKG2D配体ULBP1-4和MICA/B,以及NKp30/44/46配体和DNAM-1配体Nectin-2、PVR,但ULBP1-4、NKp30/44/46配体和DNAM-1配体表达水平在两群细胞无显著差异,仅MICA/B在乳腺癌CSCs表达水平显著低于分化型乳腺癌细胞;③pcDNA3.0-MICA表达质粒和pcDNA3.0-MICB表达质粒转染乳腺癌CSCs显著上调其MICA和MICB表达;④乳腺癌CSCs的MICA和MICB表达上调后,刺激NK细胞分泌的INF-γ量显著上升,MICA/B或NKG2D封闭抗体预处理能够抑制乳腺癌CSCs刺激NK细胞分泌INF-γ;⑤乳腺癌CSCs的MICA和MICB表达上调后,增加乳腺癌CSCs刺激NK细胞表达CD107a和分泌的Granuzyme B的能力;⑥乳腺癌CSCs的MICA和MICB表达上调后,乳腺癌CSCs对NK细胞杀伤敏感性增加,而阻断MICA/B或NKG2D则显著降低乳腺癌CSCs对NK细胞杀伤敏感性;⑦乳腺癌CSCs的MICA和MICB表达上调后,NK92细胞在体内对乳腺癌CSCs的清除率增加。三、初步揭示miR-20a、miR-106a和miR-320a对乳腺癌CSCs MICA/B表达和逃逸NK细胞杀伤效应的调控作用:1.靶向MICA/B的miRNA分子抑制乳腺癌CSCs MICA/B蛋白表达水平:①荧光定量PCR检测发现MICA和MICB mRNA表达水平在各株乳腺癌细胞的CSCs和分化型细胞差异不显著;②生物信息学预测发现miR-20a和miR-106a可能同时靶向MICA和MICB mRNA的3’UTR,此外miR-320a可能靶向MICB mRNA的3’UTR;③荧光定量PCR检测表明miR-20a、miR-106a和miR-320a在乳腺癌CSCs的表达水平均显著高于分化型乳腺癌细胞;④双荧光素酶报告基因实验证实,MICA/B mRNA的3’UTR的片段显著抑制MICA/B的表达;成熟miRNA-20a和miRNA-106a通过与MICA 3’-UTR互补结合,在转录后水平抑制MICA的表达;miR-20a、miR-106a和miR-320a均通过与MICB 3’-UTR互补结合抑制MICB表达;⑤流式细胞术检测发现,转染Anti miR-20a inhibitor和Anti miR-106a inhibitor均能不同程度提高乳腺癌CSCs MICA/B表达水平,其中以Anti miR-20a inhibitor作用最为明显;转染Anti miR-320a inhibitor能显著上调MICB表达。2.靶向MICA/B的miRNA调控作乳腺癌CSCs对NK细胞杀伤效应的逃逸特性:①ELISA法检测发现,下调miR-20a、miR-106a和miR-320a表达可以促进乳腺癌CSCs刺激NK92细胞分泌INF-γ,其中以miR-20a和miR-320a的作用尤其显著,封闭MICA/B或NKG2D功能则能抑制Anti miR-20a inhibitor、Anti miR-106a inhibitor和Anti miR-320a inhibitor的部分功能;②下调miR-20a、miR-106a和miR-320a表达增加乳腺癌CSCs刺激NK细胞表达CD107a和分泌的Granuzyme B的能力;③下调miR-20a、miR-106a和miR-320a表达使乳腺癌CSCs对NK细胞杀伤敏感性增加,而阻断MICA/B或NKG2D则显著降低乳腺癌CSCs对NK细胞杀伤敏感性;④下调miR-20a、miR-106a和miR-320a表达后NK92细胞在体内对乳腺癌CSCs的清除率增加。四、发现诺帝对胶质瘤CSCs的诱导分化治疗作用及其机制:1. Nordy在体外诱导胶质瘤CSCs分化,降低胶质瘤CSCs比例:①Nordy处理上调胶质瘤CSCs的GFAP阳性比例,下调胶质瘤CSCs的干细胞相关基因表达水平,导致细胞周期动态变化;②Nordy降低CD133+胶质瘤CSCs比例及胶质瘤细胞成球能力;③花生四烯酸-5-脂氧化酶（ALOX-5）是Nordy的作用靶点:Nordy处理能够显著抑制ALOX-5的脂氧化酶活性;ALOX-5特异性表达于胶质瘤组织且在胶质瘤CSCs高表达;Nordy抑制胶质瘤CSCs增殖和形成软琼脂克隆,降低胶质瘤细胞CD133+比例和成球能力,而ALOX-5代谢产物LTB4则逆转Nordy的这些抑制作用。2. Nordy抑制胶质瘤CSCs成瘤和移植瘤生长,诱导移植瘤中胶质瘤CSCs分化:①Nordy预处理延长胶质瘤CSCs在裸鼠体内的成瘤潜伏期,减小移植瘤体积,使移植瘤CD133+胶质瘤CSCs比例减低,而GFAP阳性细胞比例升高;②Nordy治疗荷瘤鼠抑制移植瘤肿瘤生长,且停药后抑瘤效果优于胶质瘤化疗药BCNU ;③Nordy治疗降低移植瘤CD133+胶质瘤CSCs比例,而BCNU治疗组CD133+胶质瘤CSCs比例升高;④Nordy治疗组移植瘤细胞成球能力显著低于对照组,BCNU治疗组移植瘤细胞成球能力显著高于Nordy组和对照组;⑤Nordy治疗组移植瘤GFAP阳性细胞比例显著高于BCNU组和对照组。综上所述,本研究的主要结论是:（1）乳腺癌CSCs对NK细胞杀伤效应的抵抗特性是由于乳腺癌CSCs低表达激活性NK细胞配体MICA/B导致;乳腺癌CSCs低表达MICA/B的原因是miR-20a、miR-106a和miR-320a在转录后水平抑制MICA/B的蛋白表达,抑制这些miRNA表达和功能则增加乳腺癌CSCs对NK细胞杀伤效应的敏感性。以上结果提示,乳腺癌CSCs对NK细胞杀伤效应具有逃逸特性,其机制与miRNA下调杀伤相关分子有关。（2） Nordy处理能够诱导胶质瘤CSCs分化,Nordy抑制胶质瘤CSCs增殖和降低胶质瘤CSCs比例的效应与Nordy对胶质瘤CSCs高表达ALOX-5的5-脂氧化酶活性抑制作用有关;Nordy预处理能够降低胶质瘤CSCs的体内成瘤能力,抑制荷瘤鼠移植瘤生长,Nordy的抗胶质瘤效应与降低胶质瘤CSCs比例有关;
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