富硒酵母的选育、发酵条件优化及其应用研究

论文摘要

硒是维持人体正常生命活动所必需的元素之一,缺硒会导致多种疾病的发生。天然食品中硒含量普遍较低,紧靠天然食物中的硒并不能满足人的正常需要,要保证人体健康,防治有关疾病,就应当有充分的硒摄入,通过摄取足够的硒来预防有关疾病的发生显得尤其重要,而无机硒毒性较高不能被人类所利用,通过植物和微生物将无机硒转化成有机硒是目前研究的热点,但植物体内的硒含量普遍较低,因而通过微生物转化可以为人类提供高产价廉的有机硒产品。本文以实验室保存的生香活性干酵母为出发菌株进行了微生物富集硒的研究,主要工作如下：（1）通过对出发菌株进行物理与化学复合诱变,获得了一株高生物量、高硒含量的菌株ZS-Y10。对诱变后菌株ZS-Y10的发酵培养条件进行了优化,通过Plackett-Burman实验得出转速、装液量、初始pH对富硒酵母的生物量影响最为显著。再通过响应面法最终确定富硒酵母的培养条件为：硒含量为25ug/ml的麦芽汁培养基中,温度30℃,初始pH4.75,转速185r/min,接种量10%,装液量65mL/250mL,培养时间为40h,该酵母的生物量提高到13.69g/L,总硒含量提高到1310.34ug/g,比出发菌株分别提高了65%和53%。（2）初步研究了酵母ZS-Y10中谷胱甘肽过氧化物酶的酶活。在上述最优的发酵条件下,酵母突变株ZS-Y10的谷胱甘肽过氧化物酶活达到16.8U,是出发菌株—活性干酵母的3.2倍。该酵母在含Cu2+的培养基中生长时,其GSH-Px（?）舌性比未添加Cu2+培养时要高。在培养基里添加10-3mol/L的CuSO4,其GSH-Px活达到68.8U。（3）利用超声波辅助酶法对酵母菌进行破壁处理,以提取胞内硒蛋氨酸,并利用毛细管电泳进行测定。得到的最佳毛细管条件为：100mmol/L的Tris-磷酸为运行缓冲液,pH 3.0,分离电压25KV,柱温20℃,检测波长215nm,14min时出现硒蛋氨酸的特征峰,且分离效果较好。硒蛋氨酸浓度在5.0～1 OOug/mL时,浓度和峰面积有着良好的线性关系。线性回归方程为：Y=4560X-12447,R2=0.9995,线性关系良好。以信噪比（S/N）为3计,该毛细管电泳条件下,硒蛋氨酸的检测限为0.5ug/mL。利用超声波辅助酶法来提取酵母细胞中的硒蛋氨酸,过程中硒蛋氨酸的含量有一定损失,提取效率为88%。（4）酵母ZS-Y10在含盐量为15%的含硒麦芽汁培养基中,可以生长代谢,但已受到部分抑制,到盐分为19.0%已经不能生长。通过正交试验确定,在加入15%的NaCl之后的麦芽汁培养基中,初始硒浓度为20ug/mL,摇床转速为180r/min,初始pH 5,装液量50mL/250mL,30℃下培养40h,酵母ZS-Y10的的生物量达到最高。将培养好的富硒酵母菌液加入到酱醅中进行后酵增香,酱油中各种基本成分的含量有所升高,并且酱油中总硒含量为1.10mg/L,其中有机硒含量为0.8mg/L。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 硒的概述
• 1.1.1 硒的理化性质
• 1.1.2 硒的生物学功能
• 1.1.3 硒在人和动物体内的代谢
• 1.1.4 硒蛋氨酸的研究现状
• 1.1.5 生物体补硒方式
• 1.2 富硒酵母的研究与开发
• 1.2.1 酵母的生物学特征及作为富硒载体的优越性
• 1.2.2 酵母富集硒的主要途径
• 1.2.3 酵母菌同化无机硒的机理
• 1.2.4 富硒酵母国内外的研究情况概述
• 1.3 富硒营养酱油的开发
• 1.3.1 硒酱油的生产工艺
• 1.3.2 酵母在酱油酿造生产中的应用
• 1.3.3 富硒酵母在酱油生产中的应用
• 1.4 立题思路与研究内容
• 1.4.1 立题思路
• 1.4.2 研究内容
• 第2章 复合诱变原生质体选育富硒能力强的酵母菌株
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 菌种
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 酵母菌硒含量的测定
• 2.2.2 酵母菌生物量的测定
• 2.2.3 酵母菌的培养方法
• 2.2.4 酵母生长曲线的绘制
• 2.2.5 原生质体的制备及复合诱变流程
• 2.2.6 诱变后酵母菌株的传代稳定性实验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 原生质体的制备和再生
• 2.3.2 紫外照射时间对酵母原生质体致死率的影响
• 2.3.3 5-氟尿嘧啶的浓度和作用时间对酵母原生质体致死率的影
• 2.3.4 诱变菌株ZS-Y10的形态观察及遗传稳定性研究
• 2.4 本章小结
• 第3章 响应面法优化酵母菌ZS-Y10富硒发酵条件
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 菌种
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酵母ZS-Y10培养方法
• 3.2.2 富硒酵母ZS-Y10的硒含量及生物量的测定
• 3.2.3 活性干酵母富硒发酵条件的单因素实验
• 3.2.4 响应面法优化酵母ZS-Y10的富硒发酵条件
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 活性干酵母富硒培养条件的单因素实验
• 3.3.2 响应面法优化酵母ZS-Y10的富硒发酵条件
• 3.3.3 验证性实验
• 3.4 本章小结
• 第4章 酵母ZS-Y10中谷胱甘肽过氧化物酶活性的初步研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要仪器设备
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 菌种
• 4.1.4 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 酵母培养方法
• 4.2.2 酵母细胞破碎
• 4.2.3 还原型谷胱甘肽的测定
• 4.2.4 GSH-Px酶活的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 活性干酵母及酵母突变株ZS-Y10中GSH-Px的活性
• 4浓度对酵母GSH-Px的影响'>4.3.2 发酵培养基中不同的CuSO₄浓度对酵母GSH-Px的影响
• 4.4 本章小结
• 第5章 毛细管电泳法测定富硒酵母ZS-Y10中硒蛋氨酸含量
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 主要仪器设备
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 菌种
• 5.1.4 培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 硒蛋氨酸标准溶液的配制
• 5.2.2 酵母ZS-Y10培养方法及菌体收集
• 5.2.3 富硒酵母中硒蛋氨酸酶法提取
• 5.2.4 毛细管电泳的分析条件
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 毛细管电泳条件的优化
• 5.3.2 硒蛋氨酸标准曲线的制作
• 5.3.3 酵母ZS-Y10中硒蛋氨酸含量的测定
• 5.3.4 方法的加标回收率
• 5.3.5 精密度实验
• 5.3.6 硒蛋氨酸标准溶液及酵母ZS-Y10中的硒蛋氨酸的测定
• 5.4 本章小结
• 第6章 富硒酵母ZS-Y10在酱油生产中的应用
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 主要仪器设备
• 6.1.2 主要原料及试剂
• 6.1.3 菌种
• 6.1.4 培养基
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 酵母菌生物量的测定
• 6.2.2 酵母ZS-Y10的耐盐性实验
• 6.2.3 在含NaCl培养基中ZS-Y10培养条件的优化
• 6.2.4 酵母ZS-Y10在含盐培养基中生长曲线的绘制
• 6.2.5 酱醅中加入酵母ZS-Y10培养液后酵增香实验
• 6.2.6 酱油各项指标的选择及检测
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 酵母ZS-Y10的耐盐性分析
• 6.3.2 酵母ZS-Y10培养条件的优化
• 6.3.3 酵母ZS-Y10生长曲线的绘制
• 6.3.4 酱醅中加入酵母ZS-Y10培养液后酵增香实验
• 6.4 本章小结
• 第7章 结论与展望
• 7.1 全文结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢