论文摘要
目的:观察内源性及外源性EPO对脱离视网膜感光细胞的保护作用并探讨其可能机制。方法:采用视网膜下腔注射1.4%透明质酸钠建立大鼠RD模型,分别于不同时间点检测EPO和EPOR的mRNA和蛋白表达水平的变化并采用免疫组织化学方法进行定位。为观察EPOsR对正常视网膜神经元存活的影响,2、20、200 ng EPOsR分别注入正常大鼠玻璃体腔,注射前记录FERG,注射后3 d再次进行FERG检查及视网膜神经元TUNEL凋亡原位检测;注射后7 d进行光学显微镜和透射电镜检查。为了观察内源性EPO对RD后感光细胞的保护作用,2、20、200 ng EPOsR分别注入大鼠RD模型玻璃体腔。RD后3 d进行TUNEL检测及Western-blot方法和免疫荧光检测Caspase-3活性;于RD后14 d进行组织病理学检查及ONL厚度测量。EPO 400 ng注入大鼠玻璃体腔,以评价EPO的安全性。为了进一步验证EPO对脱离视网膜感光细胞的保护作用,100、200、400 ng EPO分别注入大鼠RD模型玻璃体腔,于RD后3 d进行TUNEL检测及EPOR、Caspase-3和Bcl-XL表达的检测;于RD后第14 d、28 d、2个月进行组织病理学检查及ONL厚度测量。为了观察EPO对信号转导途径的影响,400 ng EPO注入大鼠RD模型玻璃体腔,采用Western-blot分别检测JAK2、p-JAK2、Akt、p-Akt、ERK-1/2、p-ERK-1/2、STAT5、p-STAT5、NF-κB、p-NF-κB的表达水平。结果: RD后EPO和EPOR的mRNA表达均上调,均于RD后48 h达到高峰。EPO和EPOR的mRNA表达水平分别于RD后12 h、6 h显著高于正常对照组（P<0.05）;同样EPO和EPOR的蛋白表达水平也呈现相同趋势,均于RD后3 h显著高于正常对照组（P<0.05）。玻璃体腔注射EPOsR前后各组a波、b波的潜伏期及振幅无统计学差异（P>0.05）;OPs的P4潜伏期和各子波总振幅也无统计学差异（P>0.05）;全层视网膜神经元TUNEL凋亡原位检测未见凋亡细胞;光学显微镜和透射电镜检查均未见明显组织病理性改变。RD后玻璃体腔给予EPOsR可加剧感光细胞凋亡,且具有剂量依赖性。Caspase-3活性检测结果趋势与之相一致。14 d时,正常对照组、RD组、RD+PBS组、RD+EPOsR 2、20、200 ng组ONL厚度分别为:（47.39±3.39）μm、（33.96±3.54）μm、（31.83±5.21）μm、（31.40±2.63）μm、（24.99±2.06）μm、（19.30±3.71）μm;RD+EPOsR 200 ng组与其他各组间差异有统计学意义（P<0.05）。玻璃体腔注射EPO没有改变视网膜结构和功能。RD后玻璃体腔补充重组大鼠源性EPO 100、200、400 ng可见凋亡细胞减少,且具有剂量-效应关系。Caspase-3的活性呈现相应趋势。RD后14 d,正常对照组、RD组、RD +PBS组、RD+EPO 100、200、400 ng组ONL厚度分别为:（45.70±1.53）μm、（35.00±1.66）μm、（34.79±1.15）μm、（34.60±1.02）μm、（36.82±1.23）μm和（40.20±2.41）μm。RD后2个月,各组ONL厚度分别为:（46.74±1.97）μm、（14.51±1.42）μm、（14.70±1.19）μm、（18.17±1.23）μm、（26.28±4.25）μm和（34.00±2.40）μm。RD后14 d及2个月感光细胞的内外节的长度及排列规则程度均优于单纯RD对照组。Western-blot分析结果显示RD后玻璃体腔补充外源性EPO对EPOR表达无影响,但可以抑制Caspase-3活性并增强Bcl-XL表达。RD后玻璃体腔注射外源性EPO对总JAK2、总Akt、总ERK-1/2、总STAT5、总NF-κB水平均无改变,但显著增加了JAK2、Akt、ERK-1/2的磷酸化水平。结论: RD后大鼠视网膜由于缺氧EPO和EPOR表达均增强,48 h达到高峰,大鼠神经视网膜大部分层次均能表达EPO和EPOR;玻璃体腔注射200 ng以下剂量的外源性EPOsR虽然不影响正常状态下视网膜神经元的存活,但可加剧RD状态下视网膜感光细胞的凋亡;玻璃体腔注射EPO无视网膜毒性; RD后玻璃体补充外源性EPO可通过抑制Caspase-3活性并增强Bcl-XL表达以发挥保护感光细胞的作用;PI-3K/Akt、MAPK/ERK-1/2可能均参与了EPO对RD后感光细胞的保护作用;6. EPO可作为一种重要的神经保护剂。
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