促血管生成活性肝素衍生物的研究

论文摘要

目的和背景 利用促血管生成因子可以有效治疗缺血性疾病,但存在不少问题,如这些昂贵的生长因子体内半衰期短,使用剂量大,而且全身给药还有诱发肿瘤的危险。实际上,机体组织在缺血缺氧时,局部能分泌和表达促血管生长因子,肝素与之有高亲和性,可以提高它们的稳定性,并且是这些生长因子发挥作用所必需的。据此,本课题拟以肝素为母体,研制新型衍生物,专一用于促血管生成,为缺血性疾病的治疗提供一种新药。 方法 采用有机溶剂分级沉淀法、过氧化氢降解法获得不同分子量的肝素衍生物,并分别对其进行多硫酸化、脱硫酸化修饰,测定这些衍生物的有机硫酸根含量、抗凝效价,并用高效液相色谱法对肝素衍生物的平均分子量进行了测定。利用小鼠心肌缺血模型检测制备的肝素衍生物促血管生成活性,通过免疫组化方法考察小鼠缺血心肌酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)促血管生长因子的表达情况;利用复合染色方法检测aFGF、VEGF在小鼠缺血心肌的表达及外源性肝素衍生物在小鼠缺血心肌的分布情况,并考察筛选得到的两种肝素衍生物对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)血管生成和对深Ⅱ度烧伤小鼠创面愈合的影响。利用红外光谱法和核磁共振法对具有促血管生成活性的肝素衍生物进行结构测定。 结果 制备了8种不同分子量和硫酸化程度的肝素衍生物,利用小鼠心肌缺血模型筛选出具有较高促血管生成活性的肝素衍生物—高分子量肝素多硫酸化衍生物和中分子量肝素多硫酸化衍生物,免疫组化结果显示,在小鼠缺血心肌有aFGF和VEGF的表达,并且复合染色结果显示,肝素衍生物与aFGF、VEGF可以同时

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1. 缺血性疾病
• 1.1 缺血性疾病的概况
• 1.2 缺血性疾病的发病机制
• 1.3 缺血性疾病的治疗现状及存在问题
• 1.4 血管生成理论与治疗性血管生成
• 1.5 治疗性血管生成与缺血性疾病
• 2. 肝素与血管生成
• 2.1 血管内皮与血管生成的关系
• 2.2 肝素与血管内皮具有高度亲合性
• 2.3 肝素与促血管生成因子的作用
• 2.3.1 促血管生长因子的种类及特性
• 2.3.2 VEGF与血管生成
• 2.3.3 FGF与血管生成
• 2.3.4 临床实验
• 3. 本课题的设想
• 第二章 肝素衍生物的制备与检测
• 1. 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 器材
• 2. 方法
• 2.1 肝素衍生物的制备
• 2.1.1 精品肝素分级沉淀
• 2.1.2 精品肝素的降解
• 2.1.3 多硫酸化修饰
• 2.1.4 脱硫酸化修饰
• 2.1.5 高分子肝素肼的合成
• 2.1.6 肝素衍生物的纯化
• 2.2 样品有机硫酸根含量测定
• 2.2.1 电导率法测定肝素有机硫酸根含量方法的建立
• 2.2.2 样品测定
• 2.3 抗凝效价的测定
• 2.4 平均分子量测定
• 3. 结果
• 3.1 肝素衍生物的有机硫酸根含量
• 3.2 肝素衍生物的抗凝效价
• 3.3 平均分子量测定图谱及结果
• 3.4 肝素衍生物样品测定结果
• 4. 讨论
• 4.1 肝素的过氧化氢降解
• 4.2 肝素的脱硫酸化修饰
• 4.3 肝素的多硫酸化修饰
• 4.4 肝素衍生物的有机硫酸根含量测定方法
• 5. 结论
• 第三章 肝素衍生物对心肌缺血小鼠血管生成的影响及作用机制的研究
• 实验1. 肝素衍生物对心肌缺血小鼠血管生成的影响
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 动物
• 2 方法
• 2.1 心肌缺血损伤小鼠模型的制备
• 2.2 肝素衍生物促进缺血心肌血管生长的实验步骤
• 3 结果
• 3.1 肝素衍生物体内抗凝活性
• 3.2 小鼠缺血损伤心肌的病理形态学特征
• 3.3 HE病理切片结果
• 3.4 免疫组织化学染色结果
• 实验2. 肝素衍生物对心肌缺血小鼠血管生长影响的机制研究
• 一. 小鼠心肌缺血状态下aFGF、VEGF表达的检测
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 动物
• 1.3 仪器
• 2 方法
• 2.1 心肌缺血损伤小鼠模型的制备
• 2.2 aFGF、VEGF检测标本的制备
• 2.3 免疫组化操作步骤
• 2.3.1 aFGF免疫组化染色操作步骤
• 2.3.2 VEGF免疫组化染色操作步骤
• 2.4 数据处理
• 3 结果
• 3.1 aFGF检测结果
• 3.1.1 aFGF免疫组化结果
• 3.1.2 aFGF免疫组化检测定量分析结果
• 3.2 VEGF检测结果
• 3.2.1 VEGF免疫组化结果
• 3.2.2 VEGF免疫组化定量检测结果
• 二. aFGF、VEGF与肝素衍生物在缺血小鼠心肌表达的复合染色
• 1. 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 动物
• 1.3 试剂配制
• 2. 方法
• 2.1 肝素衍生物染色步骤
• 2.2 免疫组化染色步骤
• 2.3 免疫组化染色结果
• 2.3.1 aFGF与肝素复合染色结果
• 2.3.2 aFGF与肝素复合染色定量分析结果
• 2.3.3 VEGF与肝素复合染色结果
• 2.3.4 VEGF与肝素复合染色定量分析结果
• 讨论
• 1 心肌缺血损伤模型小鼠的构建
• 2 肝素衍生物分子量及硫酸化程度对心肌缺血小鼠血管生长的影响
• 2.1 分子量的影响
• 2.2 硫酸化程度的影响
• 3 aFGF与 VEGF在心肌缺血小鼠的表达
• 4 aFGF、VEGF与肝素在心肌缺血小鼠的复合染色
• 结论
• 第四章 肝素衍生物对鸡胚绒毛尿囊血管生成作用的研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 CAM模型的建立
• 2.1.1 种蛋的选择
• 2.1.2 种蛋的消毒
• 2.1.3 种蛋的孵育
• 2.1.4 孵育中的转蛋
• 2.1.5 鸡胚的检查
• 2.1.6 假气室的制备
• 2.2 肝素衍生物对 CAM血管生成的影响试验
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第五章 肝素衍生物在烧伤小鼠创面愈合中的作用研究
• 1. 材料
• 1.1 实验药品
• 1.2 实验动物
• 1.3 实验试剂的制备
• 1.3.1 实验药物的配制
• 1.3.2 硫化钠脱毛剂的配制
• 2. 方法
• 2.1 动物模型的建立
• 2.2 给药及观察方法
• 3. 结果
• 3.1 伤口肉眼观察结果
• 3.2 创面愈合时间
• 3.3 创面愈合率
• 3.4 组织学检查
• 3.4.1 HE染色结果
• 3.4.2 结果评定
• 3.5 免疫组化染色结果
• 3.5.1 免疫组化染色
• 3.5.2 免疫组化染色结果定量分析
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 第六章 具有促血管生长活性的肝素衍生物的结构测定
• 1. 药品和仪器
• 2. 方法
• 2.1 红外光谱扫描
• 13C图谱测定'>2.2 核磁共振¹³C图谱测定
• 3. 结果
• 3.1 肝素衍生物的红外扫描图谱
• 13C-NMR图谱测定'>3.2 肝素衍生物的核磁共振¹³C-NMR图谱测定
• 4. 讨论
• 小结
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表