辅酶Q10高产菌株的选育

论文摘要

辅酶Q10(Coenzyme Q10,CoQ10)又称癸泛醌、烯醌,是一种脂溶性醌类化合物。辅酶Q10作为一种重要的生化药剂,被广泛用于医疗、食品和化妆品领域。本文以豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum 1.1723）为出发菌株,通过紫外-氯化锂复合诱变和超声波诱变来获得高辅酶Q10产量的突变株,并对其发酵工艺条件进行了优化,取得以下主要研究结果:（1）采用醇碱皂化法提取辅酶Q10,并对醇碱皂化法提取工艺进行了优化,其最佳提取条件为:每克干菌体加入50mL 10%的KOH-CH3OH溶液、0.67g焦性没食子酸,在90℃下回流提取30min,迅速冷却,加入50mL/g石油醚（30-60）萃取2次,出发菌株的辅酶Q10含量为0.389mg/g。（2）以豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum 1.1723）为出发菌株,经过紫外-氯化锂和超声波诱变处理,采用罗红霉素抗性平板初筛和发酵复筛,获得一株辅酶Q10产量较高的突变株C40-05。试验结果表明:①0.1%氯化锂处理能显著提高正突变率,超声波会引起细胞壁结构与构成发生改变。②突变株C40-05胞内辅酶Q10含量为1.198 mg/g,比原菌提高了208%。③突变菌株经5次传代培养,胞内辅酶Q10产量下降2.69%,表明该突变株遗传形状稳定,可用于进一步的研究。（3）以C40-05为出发菌株,通过单因素试验和Plackett-Burman试验设计,筛选出影响细胞生长和辅酶Q10产量的主要因素为氯化钙、茄尼醇和胡萝卜汁。结合Box-Behnken试验设计,得到最佳发酵培养基配方为:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物9.0g/L,氯化钙0.3g/L,胡萝卜汁13.53ml/L,茄尼醇0.14g/L,pH为7.0。采用优化培养基,辅酶Q10产量可达5.617mg/L,比优化前提高1.2倍。（4）利用单因素试验考察了接种量、转速、初始pH值、温度和装液量对C40-05细胞生长和发酵生产辅酶Q10的影响。通过正交试验确定最佳发酵条件为:装液量12ml/250ml,初始pH 10.0,发酵温度34℃,转速220r/min,接种量3%。在此条件下,辅酶Q10的产量为28.166mg/L,比优化前提高了4倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 理化性质
• 1.2 生理学功能及应用
• 1.2.1 生理学功能
• 1.2.2 辅酶Q10 的应用
• 1.3 生产方法
• 1.3.1 动植物组织提取法
• 1.3.2 化学合成法
• 1.3.3 植物细胞培养法
• 1.3.4 微生物发酵法
• 1.4 生物合成途径
• 1.5 高产菌株的选育
• 1.5.1 常用出发菌株
• 1.5.2 传统诱变育种
• 1.5.3 构建基因工程菌
• 1.5.4 原生质体融合技术
• 1.5.5 筛选策略
• 1.5.6 培养基优化
• 1.5.7 发酵条件优化
• 1.6 辅酶Q10 的提取与检测
• 1.6.1 提取方法
• 1.6.2 检测方法
• 1.7 研究背景和主要研究内容
• 1.7.1 研究背景
• 1.7.2 主要研究内容
• 1.7.3 技术路线
• 第二章 辅酶Q10提取方法的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 辅酶Q10 标准曲线的绘制
• 2.2.2 出发菌株的选择
• 2.2.3 醇碱皂化法提取工艺参数的研究
• 2.2.4 萃取次数的研究
• 2.2.5 不同破壁方法的比较
• 2.3 小结
• 第三章 高产菌株的诱变选育
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 豌豆根瘤菌生长曲线的绘制
• 3.2.2 罗红霉素对出发菌株最小抑制浓度的确定
• 3.2.3 紫外-氯化锂复合诱变
• 3.2.4 超声波诱变
• 3.2.4.1 绘制致死率曲线
• 3.2.4.2 超声波不同处理时间诱变效果
• 3.2.4.3 突变株基本生物学特性研究
• 3.2.4.4 突变株遗传稳定性试验
• 3.3 小结
• 第四章 发酵培养基优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 碳源与氮源的选择
• 4.2.2 单因素试验
• 4.2.3 培养基优化研究
• 4.2.4 Box-Behnken 试验设计
• 4.3 小结
• 第五章 发酵条件优化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 接种量对生物量和辅酶Q10 产量的影响
• 5.2.2 转速对生物量和辅酶Q10 产量的影响
• 5.2.3 初始pH 值对生物量和辅酶Q10 产量的影响
• 5.2.4 温度对生物量和辅酶Q10 产量的影响
• 5.2.5 装液量对生物量和辅酶Q10 产量的影响
• 5.2.6 发酵条件优化
• 5.2.7 验证试验
• 5.3 小结
• 第六章 结论
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介