论文题目: 针对HIV-1 B’亚型首株SHIV及减毒痘苗病毒载体重组疫苗的构建
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 庄柯
导师: 陈志伟,张林琦
关键词: 亚型,中国恒河猴,重组痘苗病毒,疫苗
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: 在中国中部地区的河南省及其周边省份,艾滋病在该地区的有偿献血人群（PBDs）中爆发流行,并且向普通人群扩散。我们已发现该地区有33名儿童通过母婴传播途径感染了HIV-1,在没有给予任何干预措施的条件下,该地区HIV-1母婴传播率为38.4%（33/86）。通过分子流行病学调查发现在PBDs中流行的HIV-1主要是B’亚型[1],这一亚型已成为在中国流行的另一主要的HIV毒株。我们从一位河南HIV感染者体内分离到早期的HIV-1O2HNsmx2,通过序列分析证明tat/rev/vpu/env的开放阅读框是完整的。通过细胞融合实验分析发现病毒具有R5嗜性。用该B’亚型毒株的tat/rev/vpu/env替换SHIVSF33基因上HIV-1的相应部分,成功构建了首株R5嗜性的SHIV-B’WItU。重要的是,该病毒能在中国恒河猴的PBMC中复制并产生较高滴度的病毒。这个结果证明我们已经成功构建了一个新的能有效地在中国恒河猴T淋巴细胞中复制的嵌合病毒SHIV-B’wnu,我们期待将来使用SHIV-B’WHU感染中国恒河猴建立一个新的动物模型,使用这个模型研究HIV-1的致病机制,疫苗和抗逆转录病毒药物。 HIV-1在中国的快速传播使研制HIV预防性疫苗的工作迫在眉睫。在前期工作中,我们利用中国特有的痘苗病毒天坛株（VTT）成功建立了一个高度减毒的痘苗病毒载体（TT.WHU.ZCI）。以TT.WHU.ZCI为载体,我们成功构建了三个针对HIV-1 B’的候选疫苗。即分别将HIV-1 B’的gagpol和（或）env基因克隆到一个带有双启动子的载体,通过基因重组将HIV-1 B’的gagpol和（或）env基因引入到TT.WHU.ZCI基因组中。重组病毒rVTT-ZClenv能有效地将env蛋白表达在细胞表面,而通过电镜发现感染rVTT-ZCIgagpol的细胞中有HIV-1病毒样颗粒（VLP）,这表明rVTT-ZCIgagpol表达的gag蛋白能进行自我装配形成VLP。我们通过不同的免疫途径和免疫剂量接种重组病毒rVTT-ZClenv到BALB/c小鼠体内,发现肌肉内、皮内和皮下的免疫途径能诱导小鼠产生针对HIV外源蛋白特异性免疫反应。通过体内毒力实验分析发现重组病毒仍然保持病毒载体高度减毒的特性,使一种安全可靠的疫苗。这些结果证明我们首次以新构建的减毒痘苗病毒天坛株为载体构建HIV-1疫苗。这为今后特别针对华中地区流行株HIV-1 B’构建新型,有效的疫苗研究奠定了重要的工作基础。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
引言
第一章 文献综述
一、猴/免疫缺陷嵌合病毒(SHIV)研究进展
1.HIV和SIV
2.构建嵌合病毒的策略：
3.SHIV的生物学特点：
4.SHIV的作用：
二、艾滋病疫苗的研究进展：
1.减毒活疫苗：
2.基因工程亚单位疫苗：
3.核酸疫苗：
4.活病毒载体疫苗：
第二章 实验研究
一、针对HIV-1B’亚型首株SHIV的构建
1.1.实验材料和方法
1.1.1.实验仪器、试剂和耗材
1.1.1.1.实验仪器
1.1.1.2.实验试剂、耗材
1.1.2.缓冲液及溶液、培养基配方：
1.1.2.1.溶液的配制：
1.1.3.实验方法
1.1.3.1.PCR扩增env片断
1.1.3.2.PCR产物(env)的快速回收和纯化(上海华舜生物工程有限公司)
1.1.3.3.酶切回收的PCR产物(env)和载体
1.1.3.4.酶切产物的回收(Qiaquick Extraction kit回收)
1.1.3.5.载体去磷酸化及纯化
1.1.3.6.外源片断(env)克隆到载体
1.1.3.7.酶切鉴定克隆：
1.1.3.8.菌种的培养和保藏
1.1.3.9.质粒DNA的提取
1.1.3.10.感受态细胞的制备
1.1.3.11.质粒的转化
1.1.3.12.序列的测定
1.1.3.13.遗传分析
1.1.3.14.细胞转染
1.1.3.15.细胞融合实验
1.1.3.16.嵌合病毒SHIV的构建
1.1.3.17.传代细胞的培养冻存和复苏
1.1.3.18.外周血单核细胞(PBMC)的分离与培养
1.1.3.19.SHIV感染PBMC
1.1.3.20.使用p27抗原ELISA检测和定量病毒
1.1.3.21.从感染SHIV的PBMC提取病毒RNA
1.1.3.22.基于TZM-b1细胞的荧光素酶反应测定SHIV病毒感染性
1.1.3.23.SHIV-B’_(WHU)感染GHOST.CD4.CCR5/CXCR4细胞
1.1.3.24.逆转录反应(RT Reaction)
1.1.3.25.PCR扩增cDNA rev片断
1.2.实验结果
1.2.1.HIV-1 tat/rev/vpu/env基因PCR扩增、克隆、测序
1.2.2.HIV-1B’tat/rev/vpu/env片断序列分析
1.2.3.用于构建SHIV的HIV-1B’亚型env的表型特征
1.2.4.构建具有复制能力的SHIV-B’_(WHU)
1.2.5.SHIV-B’_(WHU)的侵染性和复制能力
1.2.6.SHIV-B’_(WHU)在人和中国恒河猴PBMC上的复制能力
1.3.讨论
二、针对HIV-1B’亚型，以高度减毒痘苗病毒天坛株为载体HIV-1疫苗的构建
2.1.实验材料和方法
2.1.1.实验仪器、试剂和耗材
2.1.2.缓冲液及溶液、培养基配方：见1.1.2.
2.1.3.实验方法
2.1.3.1.穿梭载体的制备
2.1.3.2.同源重组及重组病毒的单斑筛选、纯化和鉴定
2.1.3.3.活细胞免疫染色法对重组病毒筛选和纯化
2.1.3.4.病毒在vero细胞中增殖
2.1.3.5.病毒的纯化
2.1.3.6.病毒滴度(Titer)的测定
2.1.3.7.免疫染色
2.1.3.8.真核表达gp120蛋白
2.1.3.9.蛋白质凝胶电泳和免疫印迹(Western Blot)
2.1.3.10.电镜观察HIV病毒样颗粒的形成
2.1.3.11.HIV阳性血清体外灭活
2.1.3.12.重组病毒免疫小鼠
2.1.3.13.ELISA检测小鼠抗体
2.2.实验结果
2.2.1.HIV-1B’_(WHU)env和gagpol基因PCR扩增、克隆、测序及分析
2.2.2.各种穿梭载体的制备
2.2.2.三种重组痘苗病毒的构建
2.2.3.纯化重组病毒的鉴定
2.2.4.重组痘苗病毒表达蛋白鉴定
2.2.5.重组病毒表达的gag蛋白的自我装配
2.2.6.gp120在真核表达载体上的蛋白表达
2.2.7.重组病毒增殖和滴度的测定
2.2.8.重组痘苗病毒的体内毒力
2.2.9.重组痘苗病毒的免疫原性
2.3.讨论
三、总结
参考文献
博士期间已发表和待发表论文及获奖情况
致谢
发布时间: 2006-03-27
参考文献
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