外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939的生物学作用及其分子机制的研究

论文摘要

第一部分外源性IL-6对QBC939细胞凋亡及BcI-2 mRNA表达的影响背景胆管癌是一种来源于胆管上皮的,具有去分化及侵略性特征的恶性肿瘤,它的发病经过一个从正常胆管上皮细胞转变为炎症胆管上皮细胞,然后去分化自主增生成为癌前病变最后癌变的过程,炎症因子在这个过程中发生了重要的作用。IL-6被认为是与胆管癌的发生发展密切相关的炎症因子,IL-6能够刺激炎性胆管上皮细胞和胆管癌细胞增殖,并且在其他细胞如CD34-造血干细胞、肝脏星状细胞、肾癌细胞株等的实验研究中发现IL-6能够通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bax、Bcl-xL等的表达从而达到抗凋亡的作用。bcl-2是一种有抑制凋亡作用的癌基因,在多种肿瘤中已经证实了bcl-2与肿瘤细胞逃避凋亡相关。将正常胆管细胞长期与感染性胆汁接触可增加Bcl-2的表达,这提示细胞因子持续刺激与Bcl-2表达的改变之间可能存在联系。目的观察外源性IL-6对胆管癌细胞系QBC939凋亡以及Bcl-2 mRNA的影响。方法1、用MTT法观察外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939增殖的作用；2、通过Annexin V/FITC和PI染色流式细胞分析检测外源性IL-6对QBC939细胞凋亡的影响。3、用RT-PCR检测外源性IL-6对Bcl-2 mRNA表达的影响。结果1、外源性IL-6处理后,QBC939增殖较对照组增高,差异有统计学意义（P＜0.01）,在一定剂量范围内,外源性IL-6促进QBC939增殖的效应有浓度依赖性,且剂量效应呈对数关系（P＜0.05）；2、外源性IL-6处理后QBC939凋亡率比对照组下降,差异有统计学意义（P＜0.01）；3、Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL外源性IL-6培养QBC939细胞24小时后,RT-PCR检测Bcl-2 mRNA含量逐渐增加,统计学差异有显著性（P＜0.01）并且与浓度正相关（r=1）。结论1、在体外试验中,外源性IL-6在一定剂量范围内呈浓度依赖方式促进QBC939细胞生长,并抑制QBC939细胞凋亡2、外源性IL-6抑制QBC939细胞凋亡可能与上调Bcl-2基因表达相关。第二部分外源性IL-6调控胆管癌细胞QBC939 Bcl-2基因表达的分子机制研究背景目前已知IL-6可以通过与广泛分布于胆管癌细胞膜表面的IL-6受体（IL-6 receptor, IL-6R）相结合形成IL-6/IL-6R复合物,激活如下两条信号通路：JAK/STAT和Ras/MAPK。IL-6/IL-6R复合物可直接激活JAK蛋白酪氨酸激酶,然后进入JAK/STAT通路激活信号分子STAT和Tec。这些信号传导途径调节凋亡相关基因的表达,从而发挥IL-6的促细胞生长、分化和抗凋亡作用。另一方面,IL-6/IL-6R复合物可诱导Src同源胶原蛋白与生长因子受体结合蛋白-2（SHP2）复合物形成和活化,然后与鸟嘌呤核苷酸交换因子结合,激活Ras蛋白。活化的Ras转导信号参与丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）途径。正常胆管细胞长期与感染性胆汁接触可增加Bcl-2的表达,且胆管癌Bcl-2的表达增加,这提示细胞因子持续刺激与Bcl-2的表达改变之间存在可能的联系。2000年,Michel等用IL-6、干扰素-a、胰岛素样生长因子-1 （insulin-like growth factor 1）处理骨髓瘤细胞,结果发现IL-6能上调Mcl-1表达,2007年有研究者在另外一项CD34+造血干细胞的实验中研究发现IL-6可以通过JAK/STAT通路上调Bcl-2表达。目的分别阻滞JAK/STAT和Ras/MAPK途径,探讨外源性IL-6调控胆管癌细胞系QBC939Bcl-2 mRNA表达的分子机制。方法1、采用IL-6刺激人胆管癌细胞QBC939使Bcl-2mRNA表达上调,再分别用JAK/STAT拮抗剂AG490及MEK/ERK拮抗剂UO126处理；2、MTT法检测细胞的增殖状态,Annexin V/FITC和PI染色流式细胞仪分析凋亡情况；3、RT-PCR检测Bcl-2 mRNA水平；4、Western印迹法检测p-STAT3和p-ERK1的表达水平。结果1、U0126和AG490处理后,QBC939细胞增殖程度较IL-6组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）；2、U0126和AG490处理后,QBC939细胞凋亡率分别提高为18.8±4.13%和20.3±3.88%,与IL-6组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,但两组间无明显差异（P>0.05）；3、AG490处理后,Bcl-2 mRNA含量比IL-6组明显减少,差异有统计学意义（P＜0.01）4、对照组QBC939细胞有p-STAT3和p-ERK表达；IL-6作用于QBC939细胞株后,p-STAT3和p-ERK1含量均较对照组明显升高；AG490作用后,p-STAT3含量明显下降；UO126作用后,p-ERK1含量明显下降。结论1、IL-6可同时激活JAK/STAT和Ras/MAPK途径；2、主要通过JAK/STAT途径调节QBC939细胞Bcl-2 mRNA表达。第三部分外源性IL-6对QBC939裸鼠移植瘤生长的影响背景BALB/C裸小鼠是一种近交系小鼠,后代基因纯合程度高,个体间差异小,此种小鼠先天无毛无胸腺,T淋巴功能完全缺乏,对异种移植不发生排斥反应,因此特别适用于建立移植瘤模型。移植后的人体肿瘤在裸小鼠体内仍保持有原有组织形态、免疫学特点及特有的染色体组型。目前建立裸鼠移植瘤模型是一种较为理想的研究肿瘤在体内的生物学特性及调控机制的模型系统。目的建立QBC939裸鼠移植瘤模型,观察外源性IL-6在体内对胆管癌细胞系QBC939生长的影响。方法1、采用皮下注射法建立裸鼠移植瘤模型；2、分别使用IL-6及AG490进行腹腔注射给药,观察移植瘤生长情况。结果1、本实验成功建立裸鼠体内胆管癌皮下移植瘤模型；2、移植瘤在无药物干预时有自主生长,IL-6干预后移植瘤生长明显增快,差异有统计学意义（P＜0.05）；3、AG490组移植瘤生长较对照组明显减慢,但死亡率较高。结论外源性IL-6能够促进QBC939细胞移植瘤生长。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 前言
• 第一部分 外源性IL-6对QBC939细胞凋亡的影响及其和Bcl-2mRNA表达的关系
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939 Bcl-2表达的影响及其的可能分子机制
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 外源性IL-6对QBC939裸鼠移植瘤生长的影响
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果