论文摘要
目的1.检测三种常见肝细胞系免疫相关分子的表达模式；2.比较不同复制水平的HBV对不同肝细胞系天然免疫相关分子表达的影响；3.探索HepG2与HepG2.2.15细胞IL-10的表达差异及可能机制。方法1.应用RT-PCR技术检测不同肝细胞系（HepG2, HepG2.2.15, Huh7）免疫相关分子的表达情况。2.HBV可复制质粒pHBV1.3和pBS-HBV1.3分别转染HepG2和Huh7细胞,real time RT-PCR检测天然免疫相关基因TLRs、RLRs等的表达；CMIA法检测转染后细胞上清中抗原表达水平；real time RT-PCR检测上清中HBV DNA水平。3.PCR及测序鉴定HepG2.2.15细胞中IL-10 mRNA的表达；ELISA检测进一步证实HepG2.2.15细胞上清中IL-10蛋白的表达；在利用抗病毒干预处理和HBVsiRNA、IL-10siRNA转染HepG2.2.15细胞后,real time PCR检测细胞上清中HBV DNA及细胞IL-10mRNA表达变化,CMIA检测HBsAg与HBeAg的表达,ELISA检测IL-10蛋白的表达。4.各种处理后real-time PCR、western blot检测STAT1、MyD88、NF-κB分子在HepG2.2.15细胞中的表达。结果1.RT-PCR结果显示：HepG2、HepG2.2.15、Huh7三种肝细胞系能表达一系列的免疫相关分子,其中HBV稳定复制的HepG2.2.15细胞与HepG2相比,表达上调的有：TGF-β1、IL-10、IL-10R、TNFR、HLA-A、MICB;而表达下调的有：IL-7、IL-15、IL-12p35、IL-15R、HLA-B、RIG1、A20、DUBA。其中有趣是IL-10仅在HepG2.2.15细胞中检测到表达。2.不同可复制性HBV克隆转染不同肝细胞系后表现出不同的HBV复制能力,pBS-HBV1.3质粒无论在HepG2还是Huh7中其病毒DNA水平及抗原水平均明显低于pHBV1.3质粒,且不同复制能力的HBV对两种肝细胞系天然免疫相关分子表达模式的影响也不一样。3. HepG2.2.15细胞可以分泌表达IL-10,但pHBV1.3瞬时转染不能诱导HepG2表达IL-10,提示IL-10的表达可能与HBV瞬时表达无关而与HBV持续复制相关。4. IL-10-siRNA转染HepG2.2.15后,抑制了IL-10蛋白及mRNA的表达,但对HBV的表达无明显影响。5. HBVsiRNA质粒能抑制HepG2.2.15细胞系HBV抗原及HBV DNA水平,但对HBV DNA的影响没有统计学意义。HBVsiRNA可下调IL-10的蛋白水平。6.拉米夫定可显著降低HepG2.2.15细胞HBV抗原表达及HBV DNA复制水平,同时下调IL-10的表达及mRNA转录。但其它非特异性抗病毒免疫制剂的处理对HepG2:2.15细胞HBV DNA复制水平的影响均无统计学意义。除了poly（IC）升高IL-10的蛋白水平,其他处理不同程度的降低了IL-10的蛋白水平,但对NF-κB和MyD88的表达均没有明显影响。所有处理均影响STAT1的表达。结论1.HepG2、HepG2.2.15、Huh7三种肝细胞系能表达一系列的免疫相关分子,且不同肝细胞系的表达模式存在一定的差异,这些差异主要出现在HepG2细胞和HepG2.2.15细胞之间,而HepG2与Huh7之间最大的差异是前者不表达TLR7,最有意思的是仅HepG2.2.15细胞检测到IL-10的表达。2.HBV在肝细胞系中的复制影响了一些天然免疫相关分子的表达。pBS-HBV1.3质粒在肝细胞系中的HBV复制能力较pHBV1.3低,不同程度的HBV复制对肝细胞系天然免疫相关分子表达的影响之间有一定的差异。3. HepG2.2.15细胞表达IL-10,但其表达和调控机制是不依赖于NF-κB、MyD88和HBV DNA水平的,STAT1途径可能参与了HepG2.2.15细胞中IL-10的表达调控,但并非唯一途径。活化TLR3途径可能参与了该细胞系中IL-10的表达调控,但这种调控是不依赖于HBV DNA、NF-κB和MyD88的,其具体机制还需进一步研究。本研究的创新点1.以HepG2、HepG2.2.15和Huh7三种常见肝细胞系为研究对象探讨了免疫相关分子在肝细胞系的表达情况,并通过用不同复制能力的HBV质粒转染不同肝细胞系后检测不同时间点的天然免疫相关分子表达变化,动态观察了不同程度HBV复制对肝细胞天然免疫相关分子表达模式的影响。2.发现常见肝细胞系中仅HBV稳定表达的HepG2.2.15细胞分泌表达IL-10,且HBV瞬时表达不能诱导HepG2表达IL-10,并对这一重要免疫调控细胞因子在HepG2.2.15细胞系中表达的可能机制进行了初步研究。本研究的意义1.初步探讨了不同肝细胞系作为HBV体外复制模型及不同程度HBV复制对肝细胞系天然免疫相关分子表达影响的差异,为HBV复制对肝细胞免疫分子表达影响的细胞模型的选择提供了一定的依据,也为HBV感染后肝脏免疫的可能机制提供了一定的依据。2.对IL-10在肝细胞系HepG2.2.15中表达的可能机制进行了初步探讨,为IL-10这一重要免疫调控分子在肝脏免疫中的作用及其表达调控提供了新的思路。
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