哺乳动物细胞内二硫键研究的新技术

论文摘要

二硫键的形成在蛋白质的合成和功能中发挥重要作用,是蛋白质结构和稳定必不可少的。在线粒体和内质网中都能形成二硫键,但它们的机制不太相同。二硫键的形成与许多重要的生命过程相关,例如,凋亡,老化和呼吸链的调节。为了研究细胞内的二硫键,我们利用了氧化还原敏感的绿色荧光蛋白(roGFP)。roGFP能够实时观察细胞内的二硫键形成势。为了在亚细胞水平研究二硫键的形成,我们在细胞内稳定表达了roGFP,将细胞器信号肽和roGFP融合表达,使roGFP定位在不同的细胞器中,测定这些细胞器形成二硫键的氧化还原势。我们发现胞浆最还原,内质网,高尔基体最氧化,能够形成蛋白质的二硫键。生命过程十分复杂,因此我们希望能够多重标记细胞。我们将细胞器的信号肽构建到Halotag基因上,使其能够在定位于不同细胞器。Halotag是一种新的细胞成像技术。它的反应底物可以更换成不同的荧光染料。蛋白标签和染料的共价结合是高特异性的,在生理条件下,反应速率很快,而且是不可逆的。为了研究含有二硫键的蛋白质的相互作用,我们发明了一种依赖于SNAP的蛋白片段互补技术。在我们的实验中,报告蛋白SNAP (衍生于hAGT)被拆分成两个没有活性的片段,相互作用的两个蛋白分别和拆分的两个片段融合表达。蛋白的相互作用,促使拆分片段靠近,发生重装配,恢复SNAP的活性,SNAP的活性可以通过含有荧光基团的SNAP的底物检测。最后,我们确定了一对SNAP拆分片段,它们可以通过融合的相互作用的蛋白,互补装配,形成完整的蛋白,恢复可以被检测到的完整蛋白的活性。这项技术拥有PCA和共价标记融合蛋白SNAP的优点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 二硫键的生理学意义
• 1.2 Halotag的应用
• 1.3 蛋白质相互作用的研究
• 1.4 研究的目的和意义
• 第二章 实验试剂、仪器和溶液的配制
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒
• 2.3 酶和试剂
• 2.4 实验仪器
• 2.5 溶液配制
• 第三章 实验方法
• 3.1 实验流程图
• 3.2 实验方法
• 第四章 结果与讨论
• 4.1 利用roGFP测定细胞内的氧化还原势
• 4.2 将细胞器的信号肽构建到Halotag基因上
• 4.3 SNAP蛋白片段互补实验
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢