Bt毒素在矿物和土壤胶体上的吸附和残留研究

论文摘要

转Bt基因作物发展迅速,其释放的毒素可能在土壤中积累,影响土壤生态系统的功能和生物多样性,引发环境安全问题。本文研究了Bt毒素在矿物（蒙脱石、高岭石、针铁矿和二氧化硅）和土壤（红壤、砖红壤、黄棕壤和黄褐土）胶体表面的吸附特性,用动力学和热力学方法探讨了Bt毒素的吸附规律和时间、温度、pH、低分子量有机酸盐、无机配体等因素对吸附的影响,并用红外光谱、圆二色谱和荧光光谱等观察了供试胶体吸附对Bt毒素结构的影响,剖析了被吸附Bt毒素的解吸规律,还研究了在有或无外源微生物条件下土壤中外加Bt毒素的残留特性。本研究将土壤化学与现代生物技术相融合,为转Bt基因植物代谢产物的环境效应及生态安全评价提供参考。主要结果如下:1)Bt毒素在供试胶体表面的等温吸附曲线为L型,可用Langmuir和Freundlich方程拟合,且Freundlich方程拟合效果更好。在Bt毒素初始浓度为0-1 000 mg L-1时,其在矿物胶体表面的吸附量随温度升高而减少,在供试胶体表面吸附的标准自由能（ΔrGmθ）为负值,表明该吸附是自发反应。Bt毒素除在蒙脱石表面吸附的标准焓变（ΔrHmθ）为正值是吸热反应外,在其它供试胶体表面吸附的标准焓变均为负值,是放热反应;且所有吸附的标准焓变值均小于40 kJ mol-1,说明该吸附主要是物理吸附。2)Bt毒素在供试胶体表面能快速吸附,0.25 h的吸附量约占平衡吸附量的64%-80%,1-2 h基本达平衡。该吸附可用粒子内扩散模型拟合,常数C值不为0,表明粒子内扩散速度不是Bt毒素在供试胶体表面吸附快慢的唯一控制因素。此外,其吸附动力学也符合一级方程、二级方程和Elovich方程,以二级动力学方程的拟合程度最好,说明该吸附主要受表面吸附控制。3)针铁矿、蒙脱石、高岭石、黄棕壤和黄褐土等胶体在pH 6时对Bt毒素的吸附量最大,二氧化硅、红壤和砖红壤等胶体在pH 7时吸附量最大,其吸附量一般随pH的升高而降低,这主要与Bt毒素的等电点及供试胶体的电荷零点有关。4)低分子量有机酸盐和无机配体对Bt毒素在供试胶体表面的吸附受的影响。对Bt毒素的吸附低浓度(<10 mmol L-1)有机酸盐（乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐）起抑制作用,高浓度有机酸盐起促进作用;不同有机酸盐抑制作用的强弱为草酸盐<柠檬酸盐≤乙酸盐。无机配体对Bt毒素吸附的影响与有机酸盐相反,低浓度无机盐促进其吸附,高浓度的起抑制作用,不同离子的影响为H2PO4->NO3-,NH4+>K+。5)吸附态Bt毒素很难被解吸。用0.1 mmol L-1 NaCl作解吸剂时,供试胶体表面吸附态Bt毒素的解吸率<5.3%,磷酸缓冲液作解吸剂时其解吸率<13.1%,表明它只有少部分以静电和配位的方式吸附在供试胶体表面。在有低分子量有机酸盐等配体存在条件下,NaCl和磷酸缓冲液对吸附态Bt毒素的解吸率均有显著增加（除乙酸盐体系中蒙脱石和砖红壤吸附态Bt毒素外）,表明有机酸盐的存在一定程度上增加了静电和配位吸附,影响大小为草酸盐>柠檬酸盐>乙酸盐。6)荧光光谱显示Bt毒素在282 nm激发光的作用下有酪氨酸（314.5 nm）和色氨酸（338 nm）荧光峰,其与高岭石、蒙脱石及土壤等胶体作用后色氨酸荧光峰红移了5-9.5 nm,酪氨酸荧光峰没有变化;与针铁矿和二氧化硅胶体作用后色氨酸和酪氨酸的荧光峰蓝移了0.5-1 nm,变化不明显。荧光峰的红移表明Bt毒素的吸附导致其内源荧光基团所处的分子环境极性增强。圆二色光谱表明吸附导致Bt毒素的二级结构改变,α螺旋和β折叠含量增加,而β转角和无规则卷曲含量降低。红外光谱显示,吸附后Bt毒素的酰胺Ⅰ带(1653 cm-1)和酰胺Ⅱ带(1543 cm-1)等特征光谱峰未发生明显位移,只是1055,1240和2362 cm-1处的峰消失,表明C-N残基在供试胶体吸附Bt毒素中起重要作用,且吸附后毒素的二级结构变化不明显。7)25℃条件下,初始浓度为0.3μg g-1的游离态Bt毒素随时间增加残留量逐渐减少,10天时残留量小于原始加入量的55%,培养40天后约降解了80%,表明游离态Bt毒素降解速率较快。有外源微生物存在,其降解速率更快,表明微生物能利用游离态Bt毒素;双指数模型拟合结果表明,微生物存在下其降解速率更快,且从种植非转Bt植物上壤中提取的微生物对游离态Bt毒素的利用更快。Bt毒素在供试灭菌土壤（砖红壤、黄褐土和黄棕壤）中的残留量随着培养时间的推移先增加（1-2天）后逐步减少,降解50%的时间(DT50)为10天左右,外源微生物对土壤中Bt毒素的降解速率影响不明显。初始阶段Bt毒素在3种土壤中降解速度的差异不明显,而后期在黄棕壤和黄褐土中的降解速率比在砖红壤中的慢。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 Bt毒素进入土壤的途径
• 1.2 Bt毒素与土壤活性颗粒的反应
• 1.2.1 Bt毒素在土壤活性颗粒表面的吸附固定
• 1.2.2 蛋白质在土壤颗粒表面吸附固定的机理
• 1.2.2.1 阳离子交换
• 1.2.2.2 库仑力
• 1.2.2.3 疏水力和范德华引力
• 1.2.2.4 专性吸附作用
• 1.2.3 结合态Bt毒素杀虫活性及结构变化
• 1.3 Bt毒素在土壤中的降解
• 1.4 Bt毒素对土壤质量的影响
• 1.4.1 Bt毒素对土壤物理指标的影响
• 1.4.2 Bt毒素对土壤化学指标的影响
• 1.4.3 Bt毒素对土壤生态系统的影响
• 1.4.3.1 对土壤非目标生物的影响
• 1.4.3.2 对土壤酶的影响
• 1.5 仪器分析技术在蛋白质研究中的应用
• 1.5.1 荧光光谱
• 1.5.1.1 内源荧光法
• 1.5.1.2 外源荧光
• 1.5.1.3 荧光光谱的一些新方法
• 1.5.2 圆二色谱
• 1.5.2.1 蛋白质的圆二色性
• 1.5.2.2 CD光谱在蛋白质二级和三级结构判定中的运用
• 1.5.2.3 近紫外圆二色光谱探针研究氨基酸残基的微环境
• 1.5.3 傅立叶变换红外光谱（FTIR）分析
• 1.6 本文研究的内容及意义
• 2 Bt毒素在矿物和土壤胶体表面的吸附
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 苏云金芽胞杆菌毒素制备
• 2.2.2 矿物和土壤胶体的制备
• 2.2.3 土壤胶体基本性质的测定
• 2.2.4 Bt毒素在供试胶体表面的等温吸附
• 2.2.5 不同时间下Bt毒素在供试胶体表面的吸附
• 2.2.6 不同pH条件下Bt毒素在供试胶体表面的吸附
• 2.2.7 不同浓度下供试胶体对Bt毒素的吸附
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Bt毒素在供试胶体表面的等温吸附
• 2.3.2 不同时间下Bt毒素在供试胶体表面的吸附
• 2.3.2 不同pH下Bt毒素在供试胶体表面的吸附
• 2.3.3 不同浓度的供试胶体对Bt毒素的吸附
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 低分子量有机酸盐对Bt毒素吸附的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 Bt毒素、矿物和土壤胶体的制备
• 3.2.2 吸附实验
• 3.2.3 解吸实验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 有机酸盐对Bt毒素吸附的影响
• 3.3.2 NaCl和磷酸盐对吸附态Bt毒素的解吸
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 4 无机离子对Bt毒素吸附的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 Bt毒素、矿物和土壤胶体的制备
• 4.2.2 吸附实验
• 4.2.3 无机盐离子与毒素加入顺序对Bt毒素吸附的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 无机盐离子浓度对Bt毒素吸附的影响
• 4.3.2 不同无机盐离子对Bt毒素吸附的影响
• 4.3.3 无机盐与Bt毒素加入顺序对针铁矿吸附Bt毒素的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 Bt毒素吸附的动力学和热力学研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 Bt毒素、矿物和土壤胶体的制备
• 5.2.2 吸附实验
• 5.2.3 数据处理
• 5.2.3.1 等温吸附和热力学方程
• 5.2.3.2 动力学方程
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 不同温度下Bt毒素在供试胶体表面的等温吸附
• 5.3.2 Bt毒素吸附的热力学
• 5.3.3 Bt毒素吸附的动力学
• 5.4 小结
• 6 Bt毒素吸附的光谱分析
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 Bt毒素、矿物和土壤胶体的制备
• 6.2.2 吸附解吸实验
• 6.2.3 解吸态Bt毒素荧光发射光谱和圆二光谱（CD）分析
• 6.2.4 吸附态Bt毒素的红外光谱（IR）分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 Bt毒素的荧光光谱分析
• 6.3.2 Bt毒素的圆二色（CD）发射光谱分析
• 6.3.3 Bt毒素的红外（IR）光谱分析
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 7 Bt毒素在土壤中的残留
• 7.1 引言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 Bt毒素、土壤的制备
• 7.2.2 微生物的分离提取
• 7.2.3 残留实验
• 7.2.4 Bt毒素的酶联免疫法（ELISA）测定
• 7.2.5 数据处理
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 游离态Bt毒素的残留
• 7.3.2 土壤中Bt毒素的残留
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 8 研究结论
• 参考文献
• 致谢
• 博士期间撰写与发表的文章