人卵母细胞玻璃化冷冻方案的改良—相关基础研究及初期临床应用

论文摘要

第一部分猪体外成熟卵母细胞经梯度体积变化处理后发育潜能的改变研究背景:冷冻过程中渗透压差和细胞体积的变化对卵母细胞的影响逐渐得到重视。细胞过度的扩张和收缩可以破坏细胞的显微结构甚至导致细胞死亡。因此需要评估卵母细胞对体积变化的承受能力,从而指导冷冻方案的设计。实验方法:从实验室附近屠宰中心获得猪卵巢,穿刺卵泡获得未成熟卵,经体外成熟培养后,选取排出第一极体的MⅡ期猪卵母细胞进行实验。根据早期研究获得的猪卵母细胞体积与细胞外渗透压的函数关系,推算一系列猪卵母细胞体积所对应的渗透压,配置相应渗透压浓度的蔗糖溶液。1、观察不同体积变化导致的猪卵母细胞孤雌激活的现象。体外成熟的猪卵母细胞随机分为13组,经不同渗透压浓度蔗糖溶液处理10分钟后,再移入等渗液平衡10分钟。然后用受精液与胚胎培养液依次培养,观察自发的孤雌激活现象,并记录囊胚形成率。2、观察不同体积变化对猪卵母细胞发育潜能的影响。将体外成熟的猪卵母细胞随机分为9组,经不同浓度蔗糖溶液处理后,与冻融猪精子共培养4-6小时受精,转至胚胎培养液,记录各组囊胚形成率。实验结果:1、观察不同体积变化导致的猪卵母细胞孤雌激活的现象。0.3V-0.6V和1.4V-2.0V对应的渗透压浓度下观察到一定的孤雌激活率,提示猪体外成熟卵母细胞体积的过度膨胀或收缩均能导致孤雌激活的发生。2、观察不同体积变化对猪卵母细胞发育潜能的影响。不同体积变化对猪卵母细胞发育潜能的影响。随着细胞体积的逐渐增大或缩小,其囊胚率逐渐下降。经曲线估计,发现囊胚形成率与体积变化两者间符合二元二次方程:Y=-1.104+3.945X-1.946X2:R2=0.641,模型拟合效果较好。结论:本研究发现卵母细胞的过度扩张和收缩将导致较高的孤雌激活的发生,而在一定范围内,卵母细胞的发育潜能随体积的扩张和缩小而降低。以往文献多报道渗透压变化对发育潜能的影响,而渗透压变化与细胞体积变化密切相关。本研究从体积变化的角度观察了其对卵母细胞发育潜能产生的影响,发现两者之间存在密切的函数关系。这更好的阐述了渗透压/体积对卵母细胞发育潜能影响的规律,为卵母细胞冷冻方案的设计提供了有利的基?第二部分几种改良人卵母细胞玻璃化冷冻方案的比较研究背景:人卵母细胞冷冻方案不断得到改良。本研究针对非渗透性冷冻保护剂（蔗糖）的浓度,冷冻步骤,及融解条件分别进行改良,以期提高人卵母细胞冷冻后的发育潜能。实验方法:收集IVF周期短时受精中获取的MⅠ期卵母细胞和ICSI周期中消化颗粒细胞后获取的MⅠ期卵母细胞。选择经16-24小时的体外培养后成熟的卵母细胞（MⅡ期卵母细胞）随机分组:对照组（常规冷冻法）,0.35M蔗糖组,四步法组和37℃融解组。对照组采用常规方法冷冻融解体外成熟的卵母细胞。其余各组方法如下:实验1、不同蔗糖浓度的应用:本研究使用0.35M浓度的蔗糖进行玻璃化冷冻,并相应降低融解过程中的蔗糖浓度至0.8M、0.4M、0.2M。比较对照组（0.5M蔗糖浓度）和0.35M蔗糖组对冷冻融解后卵母细胞的发育潜能的影响。实验2、不同冷冻步骤的应用:本试验在0.35M蔗糖浓度基础上使用四步法冷冻卵母细胞,与0.35M蔗糖组（二步法）进行比较,融解后观察两种冷冻方案对卵母细胞发育潜能的影响。实验3:融解过程中不同温度的应用:本实验分别在37℃和室温20～22℃条件下进行融解过程（第一步均在37℃条件下）,比较37℃融解组和四步法组（室温融解）融解后卵母细胞发育能力的影响。实验结果:1、两种蔗糖浓度的玻璃化冷冻方案之间成活率、受精率及优质胚胎率没有显著性差异。2、四步法冷冻获得了较高的成活率和受精率,但优质胚胎率较低。两组比较各项指标均无显著性差异。3、37℃融解组与室温组比较,成活率、受精率及囊胚形成率均无显著性差异。4、对四种冻融方案进行进一步综合分析,发现37℃组与对照组比较其优质胚胎率有显著性差异（P＜0.05,Fisher精确概率法）。结论:1、使用0.35M蔗糖浓度在冷冻融解后获得的成活率、受精率和优胚率与0.5M蔗糖浓度比较均无显著性差异。证明较低浓度的蔗糖（0.35M）可以应用于玻璃化冷冻方案,而且较低的蔗糖浓度可以一定程度上降低渗透压变化的幅度,更好的保护卵母细胞的发育潜能。2、使用四步法冷冻与二步法比较,没有提高卵母细胞的发育潜能,反而其优质胚胎率较低。尽管两种方案在各项指标比较中无显著性差异,但本研究提示延长细胞与冷冻保护剂接触的时间会对细胞发育造成相当程度的损伤,因此四步法并没有体现其减小细胞体积变化带来的优势。3、37℃融解组与室温组相比,没有降低卵母细胞的发育潜能,而且获得了较好的优质胚胎率和囊胚形成率,分析认为由于融解液中没有渗透性冷冻保护剂的参与,较高的温度不会增加冷冻保护剂毒性损伤。4、对四种冻融方案进行进一步综合分析,发现37℃组与对照组比较其优质胚胎率有显著性差异,进一步证明0.35M蔗糖和37℃条件融解的改良方案的确对卵母细胞玻璃化冷冻具有积极意义,可以进一步推广应用。第三部分人卵母细胞玻璃化冷冻技术的初步临床应用研究背景:人卵母细胞冷冻可以避免大量胚胎冷冻保存和剩余胚胎去向引起的一些伦理和法律的问题,能为各种原因造成的卵巢功能衰竭的妇女提供一条储备生育能力的途径,进一步优化及合理化辅助生育技术,在临床应用上有非常重要的意义。本研究目的在于探讨人卵母细胞玻璃化冷冻技术在临床应用的效果。研究方法:病人知情同意后获取的卵母细胞,消化去除颗粒细胞,选择MⅡ期卵母细胞进行冷冻。卵母细胞全部采用Medicult商品化玻璃化冷冻融解液,对成熟卵母细胞（MⅡ）进行冷冻融解。以Cryoloop为细胞承载器,每个尼龙环装载2-3个卵母细胞。融解过程第一步在在37℃条件下进行,然后采用两种环境温度进行剩余步骤:在37℃和室温20℃。所有成活卵母细胞在37℃,5%CO2培养箱内培养3小时后进行ICSI,记录受精、胚胎发育情况和妊娠结局。结果:1、11例病人移植新鲜胚胎和冷冻胚胎后未获妊娠。比较同一病人融卵周期ICSI受精率高于取卵周期,差异有显著性（卡方检验,P＜0.05）,取卵周期优质胚胎率高于融卵周期,并有显著性差异（卡方检验,P＜0.05）。2、11例病人接受冷冻供卵,卡方检验比较接受供卵-融冻卵周期与供卵者新鲜周期的受精率及优质胚胎率均存在显著性差异（P＜0.05）。3、37℃融解13个周期,室温组融解12个周期。统计分析37℃组受精率高于室温组,两者间有统计学差异（卡方检验,P＜0.05）,余各项指标无显著性差异。结论:对于取卵数较多的病人进行部分卵母细胞冷冻保存,有利于避免在新鲜周期（尤其是ⅣF周期）由于受精障碍等不可预知原因损失全部卵母细胞。而且综合考虑,将病人部分卵母细胞行玻璃化冷冻,有利于病人自身生育能力的储备,同时也给卵巢功能衰竭妇女或有遗传性疾病妇女带来生育的机会,具有重要的临床意义。37℃融解方案和20℃融解方案相比,其成活率、受精率、优胚率和着床率均有不同程度的提高,其中正常受精率有显著性差异。目前病例数量仍然较少,因此需要进一步积累临床数据以说明问题。但本实验证实RT冷冻/37℃融解方案并未增加高温下冷冻保护剂的毒性作用,是一项较安全的改良措施。综上所述,冷冻人卵母细胞可以部分弥补常规辅助生育技术的不足,获得更好的累计成功率。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分:猪体外成熟卵母细胞经梯度体积变化处理后发育潜能的改变
• 前言
• 研究背景
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分:几种改良人卵母细胞玻璃化冷冻方案的比较
• 前言
• 研究背景
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分:人卵母细胞玻璃化技术的初步冷冻临床应用
• 研究背景
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• The effect of volume changes on developmental competence of Metaphase Ⅱ stage porcine oocytes and the permeability of porcine oocytes in different concentration of EG.
• Modifications of human oocyte vitrification
• Spindle and chromosome changes of human M Ⅱ oocytes during incubation after slow freezing/fast thawing procedures
• 致谢
• 攻读学位期间发表文章
• 学位论文评阅及答辩情况表