农药靶标乙酰胆碱酯酶的分离纯化及性质研究

论文摘要

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是昆虫神经系统中最重要的酶系之一，在中枢及外周神经系统中与乙酰胆碱（ACh）受体一起参与完成神经-神经及神经-肌肉突触之间动作电位的传递，其主要生理功能是催化水解阳离子性神经递质乙酰胆碱。目前，天然产物活性物质中，研究最清楚的是AChE的酯动部位抑制剂毒扁豆碱，以其为模板合成的氨基甲酸酯类农药，已经成为农药生产上一种主要杀虫剂，有机磷、氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（AChE）有强烈的抑制作用，主要是它们能够与AChE的活性部位快速不可逆地结合，使酶失活，从而引起中毒，起到杀虫的作用。因此，提取分离纯化害虫体内乙酰胆碱酯酶并用于天然产物农药体外筛选乃至高通量筛选是研制新一代农药十分有效的方法。本文主要对粗酶液的提取条件进行了研究，采用了Sephadex G-25层析，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和SephacrylS-200凝胶过滤层析，对鳞翅目模式生物昆虫家蚕的头部粗酶提取液中的乙酰胆碱酯酶进行纯化及纯化前后酶学性质研究，实验结果表明家蚕头部乙酰胆碱酯酶的粗酶最适提取缓冲液条件为：1％Trition X-100，pH 8.0。在碱性pH条件下发现了底物（ATChI）的自身水解现象，出现在反应体系pH值大于8.5之后。纯化后得到的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和SDS-PAGE检测均为一条带，用SDS-PAGE法测得其分子量为77.8 kDa。酶的最适反应温度为37℃，最适pH为7.5，对底物碘化硫代乙酰胆碱（ATChI）的Km值为0.392 mmol／L，最适底物浓度为1.6 mmol／L，在1.6 mM底物浓度以上观察到了底物抑制现象。毒扁豆碱对纯化酶液的抑制中浓度明显低于粗酶液，说明粗酶中一些非乙酰胆碱酯酶成分对它有保护作用。瑞香狼毒素对乙酰胆碱酯酶的抑制中浓度为2×10-3mg／ml。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第一部分:乙酰胆碱酯酶的分离纯化
• 引言
• 本章摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2 供试试剂及仪器
• 1.3 家蚕头部乙酰胆碱酯酶提取条件的研究
• 1.3.1 pH对提取效率的影响
• 1.3.2 Triton X-100浓度对提取效率的影响
• 1.3.3 离心上清液和沉淀的酶活力测定
• 1.3.4 酶活力的测定
• 1.3.5 蛋白含量的测定
• 1.4 家蚕头部乙酰胆碱酯酶的分离纯化步骤
• 1.4.1 粗酶液的提取
• 1.4.2 Sephadex G-25层析纯化
• 1.4.3 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析
• 1.4.4 Sephacryl S-200层析
• 1.5 非变性和变性聚丙稀酰胺凝胶电泳
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第二部分:纯化前后乙酰胆碱酯酶的性质研究
• 引言
• 本章摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 供试酶原
• 1.2 供试试剂与仪器
• 1.3 粗酶液的酶学性质研究
• 1.3.1 粗酶液的制备
• 1.3.2 溶液的配制
• 1.3.3 粗酶液的最适反应pH
• 1.3.4 pH对底物（ATChI）的自身水解的影响
• 1.3.5 粗酶液的最适反应温度
• 1.3.6 不同ATChI浓度对酶活力的影响
• 50)的测定'>1.3.7 毒扁豆碱对粗酶液的抑制中浓度(IC₅₀)的测定
• 1.4 纯化AChE的性质研究
• 1.4.1 溶液的配制
• 1.4.2 纯化AchE的最适反应pH
• 1.4.3 纯化AchE的最适反应温度
• 1.4.4 不同ATChI浓度对AChE的影响
• 1.4.5 纯化AChE酶反应动力学常数Km的测定
• 50的测定'>1.4.6 毒扁豆碱对纯化AChE的IC₅₀的测定
• 50'>1.4.7 瑞香狼毒素对DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化后酶的IC₅₀
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 附注:在读期间已发表的论文