具有拟NGF活性的苯甲酸酯类化合物的化学及生物学研究

论文摘要

阿尔茨海默症（Alzheimer’sdisease, AD）是老年人群中一种常发生的慢性疾病。国际权威机构在2012年的报告指出,估计全球2050年老年性痴呆症患者人数将增加到1.15亿。目前,该病仍不能治愈。神经生长因子（nerve growth factor, NGF）作为治疗AD的候选药物之一,可促进神经元的生长、存活和功能维持。但是,由于不能透过血脑屏障（BBB）, NGF的临床应用受到限制。因此,在天然产物中寻找具有拟NGF活性且能透过BBB的物质已成为研究的焦点。以PC12细胞作为生物活性鉴定系统,本课题对上百种中药粗提物进行活性筛选。在前面同学发现龙胆（Gentiana rigescens Franch.）粗提物具有拟NGF活性的基础上,本课题对龙胆粗提物进行溶剂分配,正、反相色谱柱分离以及两次HPLC纯化,得到11个纯净的活性化合物。通过波谱解析和化学衍生法,确定了所有化合物的化学结构。这些化合物属于苯甲酸酯类物质,具有新的化学结构,命名为gentisides A-K。该类化合物的结构特征为：具有2,3-二羟基苯甲酸结构单元；烷基链的长度不同（碳原子的个数为17-24）；烷基链末端有无异丙基或异丁基。Gentisides A-K在1-30μM的浓度范围内可显著诱导PC12细胞发生神经突起伸长,并形成网状结构,其神经突起分化率可与NGF最佳浓度40ng/mL的相当。初步构效关系研究表明：gentisides中的碳链长度对活性影响显著,而末端基团的结构多样性对活性影响不明显。龙胆属于我国常用的传统中药材,对其有效成分的研究具有应用价值。由于gentisides单一化合物的含量低,不利于进一步研究,因此,我们利用其有效成分苯甲酸酯类混合物（n-GS）进行药效学评价。东莨菪碱模型是一种成熟的用于老年性痴呆的病理模型。本课题用新奇物体辨别实验和Y迷宫实验观察n-GS是否对东莨菪碱造模鼠的学习记忆障碍有所改善。结果表明,n-GS能明显预防造模鼠的记忆损伤。随后,本课题对n-GS的安全性进行评价。急性毒性实验结果表明,n-GS口服给药后,其半数致死量大于5g/kg,说明n-GS是一种低毒且有望用于治疗AD的有效成分。以上研究结果为n-GS的开发应用提供了实验基础。为了深入研究苯甲酸酯类物质的构效关系,课题组其他同学设计并合成了一百多种gentisides衍生物。本课题对gentisides衍生物进行生物活性测试,最终确定了2,3-二羟基苯甲酸十四酯为活性先导化合物,命名为ABG-001。为探索其拟NGF活性的作用机制,本课题利用16个与神经突起相关的蛋白抑制剂进行筛选实验。结果发现,加入MEK、PI3K和PKC的抑制剂后,ABG-001诱导PC12细胞发生的神经突起分化率均被显著抑制。对于靶点的研究,初步发现ABG-001的拟NGF活性不受NGF受体TrkA抑制剂的影响。因此,推测ABG-001通过与其它受体结合,激活MAPK/ERK、PI3K和PKC信号通路,从而诱导PC12细胞发生神经突起伸长。关于ABG-001靶点的进一步研究仍在进行中。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 缩写表
• 1 前言
• 1.1 神经退行性疾病的研究现状
• 1.2 AD的发病机制及治疗药物
• 1.3 神经营养因子与AD的关系
• 1.4 具有神经营养和保护功能的天然物质的研究
• 1.5 立题依据
• 2 具有拟神经生长因子活性的龙胆苯甲酸酯类化合物的化学及生物学研究
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 中药材样品的制备
• 2.2.2 生物活性鉴定系统
• 2.2.3 统计分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 生物活性引导下的中药筛选
• 2.3.2 具有拟神经生长因子活性的龙胆苯甲酸酯类化合物的化学研究
• 2.3.3 具有拟神经生长因子活性的龙胆苯甲酸酯类化合物的生物学研究
• 2.4 小结
• 3 具有神经保护功能的中药龙胆活性组分的体内药效学评价
• 3.1 中药龙胆活性组分n-GS的制备
• 3.1.1 实验材料与仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 结果与讨论
• 3.2 中药龙胆活性组分n-GS对模型鼠的药效学评价
• 3.2.1 实验动物与材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 结果与讨论
• 3.3 中药龙胆活性组分n-GS的急性毒性评价
• 3.3.1 实验动物与材料
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.3 结果与讨论
• 3.4 小结
• 4 具有拟神经生长因子活性的先导化合物在PC12细胞上的作用机理研究
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 生物试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 MTT实验
• 4.2.3 与神经突起分化相关的主要蛋白的抑制剂研究
• 4.2.4 统计分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 ABG-001的神经突起伸长活性的确定和细胞毒性检测
• 4.3.2 神经突起伸长信号通路的相关蛋白抑制剂的研究
• 4.4 小结
• 5 总结与展望
• 6 苯甲酸酯类及其衍生物的活性研究进展（综述）
• 6.1 抗菌活性
• 6.2 抗氧化活性
• 6.3 抗真菌活性
• 6.4 抗炎活性
• 6.5 其它活性
• 参考文献
• 附录
• 作者简介