论文摘要
研究目的：脑内Aβ的病理积聚是启动Alzheimer病（AD）长期病理级联的关键事件。脑内中性内肽酶neprilysin（NEP）与Aβ的降解有关，老龄脑NEP活性降低，可能导致高毒性Aβ42的聚集。为此，我们培养原代脑皮质神经元，通过基因转染方法使之过表达NEP，在基因和蛋白质两个水平观察NEP对神经毒物质Aβ25-35诱导神经细胞凋亡的保护作用，为Alzheimer病（AD）等退行性疾病寻求一种新的基因干预治疗途径。研究方法：（1）大肠杆菌的转化，质粒的扩增，提取及纯化。（2）质粒的酶切及电泳鉴定。（3）鼠脑原代神经元培养及鉴定：取受孕第18天的胚鼠大脑皮层，剪碎，胰蛋白酶消化，离心计数，接种至培养板和培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱中培养，并用阿糖胞苷抑制非神经细胞的增殖，纯化神经元，并对培养各阶段的神经细胞进行了观察且系统地描述它们的形态特征，应用微管相关蛋白2（MAP2）标记的免疫细胞化学方法鉴定神经元的纯度。（4）Aβ损伤细胞模型的制备：MTT法测细胞存活率，确定适当损伤细胞条件(Aβ25-3515μM，作用24小时)。（5）神经细胞转染实验：脂质体法将含NEP基因的表达载体pcDNA3.1转染培养原代神经元。（6）各种指标的检测：通过电镜观察、MTT分析及流式细胞凋亡分析观察NEP