论文摘要
许多动物实验发现，较长期的热量限制（calorie restriction，CR）可以延长龋齿类动物的寿命，提高组织对胰岛素作用的敏感性，减少胰岛素抵抗，从而减少胰岛β细胞分泌胰岛素，因此，CR对2型糖尿病的防治有较好的前景。研究显示，从实验鼠幼年开始，每天少摄取正常摄食热量的30％～50％，不但不引起营养不良，还可以比正常摄食组延长30％以上的寿命。文献报道，热量限制通过诱导酵母和线虫沉默信息调节因子2（silent information regulator 2，SIR2）高表达，从而发挥其延长生物体寿命的作用，在哺乳动物中，CR也同样通过诱导SIR2的哺乳动物同源体SIRT1高表达而调控着机体的寿命。SIR2是调节生物体衰老进程的一个重要基因，依赖NAD+去乙酰化酶活性的组蛋白，有调节染色体沉默、基因转录、基因修复等多种功能，被视为长寿基因之一。FOXO家族是转录调节基因DAF-16的哺乳动物的同源基因，在细胞物质能量代谢以及衰老调控中起着很重要的作用。FOXO家族成员是INS／IGF-1信号通路中的关键分子，是蛋白Akt的靶分子，也受SIRT1的脱乙酰化酶活性的调节，Akt可通过其磷酸化作用对FOXO家族成员进行修饰，使其由胞核转移至胞浆而失去转录活性。研究证实：INS／IGF-1衰老信号通过负向调节DAF-16以调节蠕虫的能量代谢、生长发育而调控着其衰老进程。然而，哺乳动物实验显示SIRT1可能通过减少小鼠脑细胞IGF-1结合蛋白（IGFBP1）的表达，间接增强INS／IGF-1信号通路的下传，或者通过其直接的脱乙酰化作用，进而调控其下游基因FOXO家族的功能活性而减少衰老相关基因及凋亡相关基因的表达，促进细胞抗氧化应激耐受力，从而延缓细胞的衰老。2型糖尿病（T2DM）是以胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌缺陷为特征的常见病，是世界性严重公共卫生健康问题。目前对于哺乳动物胰岛β细胞的衰老调控机制研究尚少，其衰老机制尚未明确。对β细胞衰老机制的深入探讨，将为T2DM的防治提供新的思路和基础，有着深远的意义。本课题前期实验证实，随年龄增长，大鼠胰岛β细胞衰老增加，伴随着胰岛素分泌减少。临床和流行病学调查也表明，随年龄增长，糖耐量逐渐下降，T2DM及糖耐量低减（IGT）患病率增高，动物实验也表明，在高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠模型中，β细胞衰老参与了饮食诱导的T2DM的发病。因此我们推测，在胰岛β细胞中，SIRT1基因通过其下游转录基因FOXO家族而调控着胰岛β细胞的衰老进程。本实验通过热量限制（CR）诱导SIRT1高表达而达到延缓胰岛β细胞衰老的目的，检测胰岛β细胞中SIRT1与FOXO1的表达水平，并通过图像采集和分析软件对其表达水平做进一步分析，探讨SIRT1与FOXO1表达水平在胰岛β细胞衰老进程中的相关性。以期对β细胞衰老参与T2DM发病的机制有进一步和更深刻的认识。内容和方法：1．将18月龄的健康雄性SD大鼠11只随机分为2组：热量限制（CR）组6只和对照组5只，热量限制组予正常饮食热量的60％，对照组予正常饮食，均饲养6个月。2．收集两组SD大鼠胰尾石蜡切片，分别行β-gal（β-半乳糖苷酶）染色，SIRT1、FOXO1与insulin的免疫组织化学染色，并分析SIRT1、FOXO1与衰老进程的相关性。结果：1．SIRT1蛋白相对特异地表达在胰岛细胞中，SIRT1蛋白表达可位于细胞浆中，也可位于细胞核内，以细胞浆为主，CR组胰岛细胞内SIRT1表达量高于对照组（P＜0.05）。2．FOXO1转录因子也相对特异地表达于胰岛细胞内，胞浆和胞核均有表达，从总表达量看，CR组与对照组胰岛细胞内表达未见差异（P＞0.05）；CR组胰岛内胞核FOXO1阳性率明显低于对照组胰岛内胞核FOXO1阳性率（P＜0.01）。3．胰岛素insulin的表达位于胰岛细胞质中，CR组胰岛insulin分泌量较对照组少（P＜0.05）。4．胰岛内β-Gal染色位于胞浆，呈蓝色。CR组与对照组大鼠胰岛染色均呈阳性，与对照组比较，CR组胰岛细胞胞浆β-Gal染色强度明显较低（P＜0.01）。结论：1．热量限制延缓了大鼠胰岛的衰老，并诱导了大鼠胰岛β细胞SIRT1蛋白高表达。2．FOXO1在胰岛β细胞衰老进程中担负着重要的角色，是β细胞衰老调控的一个重要关键分子，SIRT1可能通过抑制FOXO1的活性而调控着胰岛β细胞的衰老，对FOXO1转录因子的深入研究将对2型糖尿病的防治有深远的意义。3．热量限制可能改善了机体各组织对胰岛素的敏感性，从而减少了大鼠胰岛β细胞胰岛素的分泌。