论文摘要
目的小白菊内酯（parthenolide,Par）作为一种西方传统药物,除了免疫调节功效,对于来自肝脏,乳腺,前列腺,血液等的多种肿瘤细胞,在其发生发展过程中发挥良好的抑制效应,可以显著抑制多种人类肿瘤细胞生长,诱导肿瘤细胞凋亡。小白菊内酯的抗肿瘤机制与其作为NF-κB通路抑制剂息息相关,通过对NF-κB的阻断,调节细胞周期蛋白,由TNF-a通路调控众多下游基因如Bcl-2,Caspase及影响线粒体功能,显示了其在肿瘤治疗中的应用价值,但目前,国际上对Par在胃癌的研究方面还远不深入,为了探讨Par在胃癌治疗中的应用价值,我们研究了Par对胃癌细胞株SGC7901,BGC823细胞增殖,细胞周期和凋亡的影响;对胃癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响,通过检测Par在处理细胞后线粒体膜电位（△Ψm）及凋亡检测蛋白Bcl-2和Caspase基因的改变,探讨在Par诱导胃癌细胞凋亡中线粒体途径和凋亡调节蛋白Bcl-2和Caspase-8的作用,进一步阐明Par抗肿瘤作用的机制。方法1、MTT法检测不同浓度Par对肿瘤细胞的抑制作用取人胃癌细胞株SGC7901、BGC823细胞株,加入96孔板,实验组加入不同浓度的Par,对照组则加等量不含药物的培养液。Par处理24、48、72小时后,MTT法检测各孔吸光度（OD）值,计算细胞生长抑制率。2、流式细胞仪分析细胞周期消化收集各浓度Par处理24h的细胞,PI复合染液染色后,流式细胞仪检测,分析细胞周期。3、流式细胞仪检测细胞凋亡消化收集各浓度Par处理24h的细胞,Annexin V/FITC染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。4、流式细胞仪检测Par对细胞△Ψm的影响消化收集各浓度Par处理24h的细胞,罗丹明123染色后,流式细胞仪检测,分析线粒体膜电位降低细胞所占百分比。5、transwell小室检测Par对细胞体外迁移的影响以不同浓度Par处理细胞后,加入到transwell小室中,作用48h后计数穿膜细胞数。6、被覆Matrigel胶的transwell小室检测Par对细胞体外侵袭的影响以不同浓度Par处理细胞后,加入到transwell小室中,小室上层被覆Matrigel胶,作用48h后计数穿膜细胞数。7、光镜下细胞形态观察细胞接种于6孔板,以不同浓度Par处理细胞24h后,后倒置显微镜下用100×摄片,观察各组细胞形态。8、荧光显微镜下观察细胞凋亡收集以不同浓度Par处理24h的细胞,吖啶橙溶液染色,在荧光显微镜下用400×摄片,观察凋亡细胞形态。9、western blot方法检测Bcl-2蛋白的表达收集7.5μmol/L作用24,48,72h后的细胞蛋白,用western blot方法检测Bcl-2蛋白的表达。10、RT-PCR方法检测Caspase-8 mRNA的表达收集7.5μmol/L作用24,48,72h后的细胞蛋白,用RT-PCR方法检测Caspase-8基因的表达。11、统计学处理本实验所有数据用均数±标准差表示,利用SPSS11.5分析软件,采用单因素方差分析法进行差异性分析,P＜0.05被认为有显著差异。结果1、Par对胃癌细胞生长的抑制作用Par在20μmol/L以下对SGC7901、BGC823细胞生长无显著影响,60μmol/LPar分别处理SGC7901、BGC823细胞48h后对细胞生长有抑制作用（P＜0.05）,在100～200μmol/L浓度范围内,Par作用24h后,对胃癌细胞增殖有抑制作用。随着浓度的增加,对细胞的抑制率也逐渐增加。同一浓度的Par对胃癌细胞的抑制作用随着时间的延长也逐渐增强。2、Par对胃癌细胞周期分布的影响对照组SGC7901细胞的G0/G1期、S期和G2/M期比例分别为49.60%±2.45%,30.80%±2.50%,19.6%±1.37%。在经140、160、180、200μmol/L处理24h后,G0/G1期比例逐渐增高,分别为63.56%±3.28%（p＜0.05）,65.88%±1.60%（p＜0.01）,74.27%±1.13%（p＜0.01）,79.33%±3.21%（p＜0.01）,S期比例逐渐下降,分别为21.56%±0.71%,16.81%±1.82%（p＜0.01）,13.96%±0.35%（p＜0.05）,6.40%±5.56%（p＜0.05）,G2/M期比例分别为14.88%±2.78%,17.31%±0.71%,11.78%±0.97%（p＜0.01）,16.25%±1.45%。对照组BGC823细胞的G0/G1期、S期和G2/M期比例分别为63.55%±1.03%,24.88%±1.01%,11.57%±0.54%。在经140、160、180、200μmol/L处理24h后,G2/M期逐渐减少,分别为8.49%±0.12%（p＜0.05）,8.11%±0.16%（p＜0.05）,0.17%±0.04%（p＜0.01）,0.06%±0.02%（p＜0.01）,G0/G1期比例无显著变化,S期比例升高,分别为25.90%±0.70%,28.05%±13.77%,37.48%±0.95%（p＜0.01）,35.14%±0.88%（p＜0.01）。在SGC7901细胞中,160～200μmol/L的Par处理后G0/G1期比例增高、S期比例下降有统计学意义。在BGC823细胞中160～200μmol/L的Par处理后G2/M期比例下降,S期比例升高有统计学意义。3、Par对胃癌细胞凋亡的影响对照组SGC7901细胞早期凋亡率和晚期凋亡及坏死率分别为3.03%±0.75%和1.37%±0.57%,与对照组比较,经80、100、180μmol/L的Par处理24h后,,SGC7901细胞的早期凋亡率逐渐增加,分别为6.93%±2.55%,25.47%±4.93%（p＜0.05）,50.16%±2.11%（p＜0.01）,晚期凋亡和坏死率也逐渐增加,分别为6.26%±4%,11.67%±3.07%,18.95%±1.46%（p＜0.01）。对照组BGC823细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率及坏死率分别为4.34%±0.73%,3.54%±1.41%,与对照组比较,经80、100、180μmol/L的Par处理24h后,BGC823细胞的早期凋亡率逐渐增加,分别为8.64%±1.52%,19.65%±2.89%（p＜0.05）,32.78%±3.19（p＜0.01）,晚期凋亡率及坏死率也逐渐增加,分别为6.78%±1.09%,21.56%±3.19%（p＜0.05）,31.55%±3.78%（p＜0.01）,上述结果表明Par以浓度依赖方式诱导胃癌细胞产生明显凋亡,包括早期和晚期凋亡。4、Par对胃癌细胞△Ψm的影响流式细胞仪结果表明SGC7901细胞正常对照组△Ψm降低的比例为10.38%±0.73%,经80、100、160、200μmol/L的Par处理24h后,△Ψm下降的比例分别为41.33%±11.06%,73.86%±5.66%（p＜0.01）,98.8%±1.13%（p＜0.01）,99.13%±0.77%（p＜0.01）。BGC823细胞正常对照组△Ψm降低的比例为15.43%±1.24%,经80、100、160、200μmol/L的Par处理24h后,△Ψm下降的比例分别为25.5%±7.56%,75.38%±1.29%（p＜0.01）,89.23%±2.33%（p＜0.01）,91.6%±1.74%（p＜0.01）,结果表明Par以浓度依赖方式引起胃癌细胞发生线粒体膜电位去极化,提示Par可能通过降低线粒体膜电位引起细胞凋亡。5、P2ur对胃癌细胞体外迁移的影响Transwell结果表明SGC7901细胞正常对照组48h后穿膜细胞数为51±3.61,经30、50、80μmol/L的Par处理48h后,穿膜细胞数逐渐减少,分别为46±5.57,25.67±4.04（p＜0.01）,9.67±2.08（p＜0.01）。BGC823细胞正常对照组48h后穿膜细胞数为116±9,经30、50、80μmol/L的Par处理48h后,穿膜细胞数逐渐减少,分别为95.33±7.02,46±6.56（p＜0.01）,29±4（p＜0.01）,结果表明Par以浓度依赖方式抑制胃癌细胞体外迁移活性。6、Par对胃癌细胞体外侵袭的影响transwell结果表明SGC7901细胞正常对照组48h后穿膜细胞数为95.33±8.74,经30、50、80μmol/L的Par处理48h后,穿膜细胞数逐渐减少,分别为76±6.56,33±6（p＜0.01）,12.67±3.21（p＜0.01）。BGC823细胞正常对照组48h后穿膜细胞数为85.33±11.23,经30、50、80μmol/L的Par处理48h后,穿膜细胞数逐渐减少,分别为69.33±3.06,47.33±5.51（p＜0.05）,23±6.56（p＜0.01）,结果表明Par以浓度依赖方式抑制胃癌细胞体外侵袭活性。7、光镜下细胞形态观察对照组胃癌细胞其贴壁生长良好,细胞轮廓清晰,细胞间结构紧密,细胞生长旺盛,经80、100、200μmol/LPar作用后,逐渐脱落,悬浮于培养液中,贴壁细胞数量减少,细胞形态变圆,体积缩小,核出现固缩。从形态学上证实Par对胃癌细胞的生长抑制。8、荧光显微镜下观察细胞凋亡对照组的胃癌细胞核染色质着绿色,细胞核完整,经80、100、200μmol/L的Par作用后见凋亡细胞,细胞体积缩小,核染色质着橘黄色,核浓缩,有部分碎裂,呈大小不等、形态不规则的碎片,可找到凋亡小体。从形态学上证实Par诱导胃癌细胞凋亡的作用。9、Par对胃癌细胞Bcl-2蛋白表达的影响两株细胞的对照组经western blot检测可见明显的Bcl-2蛋白条带,SGC7901细胞对照组蛋白表达强度为2.65±0.08,经7.5μmol/L的Par作用24h、48h、72h后,表达强度逐渐减低,分别为2.57±0.029,2.18±0.95（p＜0.05）,1.35±0.15（p＜0.01）。BGC823细胞对照组蛋白表达强度为2.75±0.08,经7.5μmol/L的Par作用24h、48h、72h后,表达强度逐渐减低,分别为2.44±0.16,2.14±0.1,1.42±0.11（p＜0.01）。提示Par在胃癌细胞中引起Bcl-2表达下调。10、Par对胃癌细胞Caspase-8 mRNA表达的影响SGC7901细胞对照组基因表达强度为0.23±0.046,经7.5μmol/L的Par作用24h、48h、72h后,表达强度逐渐增加,分别为0.36±0.046,0.53±0.035（p＜0.01）,0.85±0.08（p＜0.01）。BGC823细胞对照组基因表达强度为0.23±0.055,经7.5μmol/L的Par作用24h、48h、72h后,表达强度逐渐增加,分别为0.35±0.092,0.55±0.073（p＜0.05）,0.82±0.035（p＜0.01）。提示Par在胃癌细胞中引起Caspase-8表达上调。结论Par具有抑制SGC7901、BGC823细胞生长,诱导其凋亡的作用,可能是通过以下的机制发挥作用的。1、Par能以剂量和时间依赖的方式抑制SGC7901、BGC823细胞生长,以剂量依赖的方式使SGC7901细胞周期阻止在G0/G1-S期,使BGC823细胞周期阻止在S-G2/M期。2、Par以剂量依赖方式降低SGC7901、BGC823细胞的线粒体膜电位,从而诱导细胞凋亡。3、Par以剂量依赖方式抑制SGC7901、BGC823细胞体外迁移和侵袭活性。4、Par以时间依赖方式下调SGC7901、BGC823细胞的Bcl-2蛋白表达水平。5、Par以时间依赖方式上调SGC7901、BGC823细胞的Caspase-8 mRNA表达水平。6、Bcl-2和Caspase-8两个基因参与了Par对SGC7901、BGC823细胞诱导凋亡的作用。